J. Kolář - Biologické rytmy a fotoperiodizmus rostlin

1. J. Kolář - Biologické rytmy a fotoperiodizmus rostlin 10: Mechanizmy fotoperiodické indukce kvetení

3. Fotoperiodická indukce kvetení • konvenční fyziologie a biochemie formulovala základní koncepce, týkající se mechanizmů fotoperiodické květní indukce • neobjasnila však podrobnosti dvou klíčových procesů: • měření délky dne/noci pomocí cirkadiánních rytmů (externí, nebo interní koincidence?) • přenos květního stimulu z listů do vzrostného vrcholu (existuje florigen? o jakou látku jde?)

4. Fotoperiodická květní indukce - místo vnímání fotoperiodického signálu • indukční fotoperiodě musí být vystaveny listy; expozice samotného apexu je neúčinná • délka dne je tedy vnímánav listech • u mnoha druhů k vyvolání kvetení postačuje, aby byla indukční délce dne vystavena jen malá část celkové listové plochy jedince schéma klasického experimentu dokazujícího vnímání délky dne v listech (z Vince-Prue 1975)

5. rostlina Nicotiana tabacumcv. Maryland Mammoth(krátkodenní) florigen list Nicotiana sylvestris (dlouhodenní) list Nicotiana tabacumcv. Maryland Mammoth(krátkodenní) • Florigen • fotoperiodický signál je přijímán v listech, ale květy se tvoří na vzrostném vrcholu • Z listů do vrcholu se tedy floémem šíří látka stimulující kvetení, nazvaná florigen. Jak ukázaly roubovací pokusy, je florigen do značné míry univerzální, stejný nebo podobný u různých druhů rostlin - dokonce i u druhů s rozdílnými fotoperiodickými reakcemi. dlouhý den z Hess 1983

6. krátký den dlouhý den dlouhý den florigen Nicotiana sylvestris (dlouhodenní) Nicotiana tabacumcv. Maryland Mammoth (krátkodenní) Nicotiana sylvestris (dlouhodenní) Nicotiana tabacumcv. Maryland Mammoth (krátkodenní) • Florigen • další příklad roubovacího pokusu květy N. sylvestris odstraněny po objevení sem nějaký obrázek s roubováním z Lang 1965

7. Problémy s florigenem • pro jeho existenci byly dlouho jen nepřímé důkazy, nikdy nebyl biochemicky identifikován (např. v extraktech z fotoperiodicky indukovaných listů). Možnosti vysvětlení byly dvě: • florigen jako samostatná látka neexistuje, indukční signál z listů je kombinace několika známých sloučenin (cukry, hormony apod.) - model propracovaný u Sinapis alba • florigen je těžko k nalezení, ale existuje a lze ho objevit s pomocí molekulární biologie možné květní stimuly transportované z listů do apexu, Corbesier a Coupland 2005

8. Molekulárně-biologické metody pro výzkum fotoperiodizmu • pro hledání zúčastněných genů jsou používány dva základní přístupy: • mutageneze a následné vyhledávání mutantů s narušenou fotoperiodickou citlivostí • QTL analýza (QTL = quantitative trait loci): Po zkřížení dvou odrůd nebo ekotypů lze podle frekvence rekombinací v potomstvu přibližně lokalizovat na chromozómech lokusy, které se podílejí na kvantitativních znacích (jako kvantitativní znak lze chápat i dobu do kvetení). Následně je možno přesnějšími technikami genetického mapování identifikovat konkrétní geny. • Po nalezení alespoň některých klíčových genů lze využít další techniky molekulární biologie - studium genetické interakce mutací v různých genech, sledování hladin mRNA nebo proteinů za různých okolností (např. na krátkém x dlouhém dni), vliv mutací nebo overexprese na genovou aktivitu, identifikace proteinových interakcí aj. Cílem je najít všechny zúčastněné geny, objasnit jejich vzájemné vztahy a nakonec popsat molekulární detaily celého procesu.

9. Fotoperiodická květní indukce - hledání genů • vyhledávání mutantů: z mutantů se změněnou dobou kvetení jsou nejlepšími kandidáty na roli ve fotoperiodické indukci takové, které mají výrazně sníženou citlivost na délku dne vliv délky dne a vernalizace na počet listů do kvetení u mutantů Arabidopsis thaliana (Koornneef et al. 1991)

10. Hd-1 Hd-2 • Fotoperiodická květní indukce - hledání genů • QTL analýza: důležitá hlavně u rýže, ale použita i u Arabidopsis a jiných druhů (např. ječmen) QTL analýza doby do kvetení u rýže, Yano et al. 1997

11. Měření času ve fotoperiodických reakcích • zjistilo se, že za měření délky dne/noci jednoznačně zodpovídá cirkadiánní oscilátor • oscilátor prostřednictvím proteinů FKF1 a GIGANTEA (GI) reguluje transkripci genu CONSTANS (CO) • protein CO především reguluje expresi genu FLOWERING LOCUS T (FT); protein FT indukuje procesy vedoucí k zakládání květů pod vzrostným vrcholem model vztahu mezi cirkadiánním oscilátorem a fotoperiodickou indukcí kvetení u Arabidopsis thaliana,Hayama a Coupland 2004

12. vysoká hladina na světle v LD Měření času ve fotoperiodických reakcích • jeden z klíčových genů fotoperiodické dráhy u A. thaliana je CONSTANS(CO) • pouze při dlouhém dni je vysoká hladina CO mRNA na světle hladiny CONSTANS mRNA u Arabidopsis thaliana na krátkém a dlouhém dni (Suárez-López et al. 2001)

13. Měření času ve fotoperiodických reakcích • mechanizmus u A. thaliana: kombinace denního rytmu s přímým účinkem světla (tedy externí koincidence) • denní rytmus: hladina CO mRNA • přímý účinek světla: hlavně stabilizace vznikajícího proteinu CO během odpoledne model mechanizmu fotoperiodického měření času u Arabidopsis,Hayama a Coupland 2004

14. Měření času ve fotoperiodických reakcích • na denní průběh hladin CO mRNA má vliv nejen cirkadiánní oscilátor, ale také přímé působení světla • příslušné molekulární interakce jsou dosti komplikované regulace exprese genu COu Arabidopsis během dne,Imaizumi 2010

15. = CO = FT • Fotoperiodizmus – mezidruhové srovnání • jak se od sebe liší mechanizmy fotoperiodické regulace u různých druhů, především mezi krátkodenními a dlouhodenními rostlinami? • Srovnání dlouhodenní Arabidopsis a krátkodenní rýže: zúčastněné geny (CO, FT) jsou homologní, ale jiné jsou jejich vztahy. U Arabidopsis indukuje protein CO transkripci FT na světle, zatímco u rýže CO inhibuje transkripci FT na světle a indukuje ji za tmy. Ovšem na regulaci FT se u rýže zřejmě podílejí ještě jiné geny! Pro objasnění je nutný další výzkum. model mechanizmu fotoperiodického měření času u rýže, Hayama a Coupland 2004

16. Fotoperiodizmus – mezidruhové srovnání • Něco konzervováno, něco ne. • Denní profily hladin mRNA u homo-logů CO a FT: v případě CO mRNA jsou dost podobné bez ohledu na druh rostliny a typ fotoperiodické reakce. Ale profily FT mRNA se výrazně liší mezi krátko- a dlouhodenními druhy. • Měření délky dne evolučně konzer-vováno, ale jeho následné propojení na fotoperiodickou reakci ne? Možná, ale nutno porovnat víc druhů rostlin. Song et al. 2010

17. FT:GUS CO:GUS • Florigen • geny CO a FT jsou silně exprimovány v cévních svazcích listů - jejich funkce tedy může být těsně spojena s regulací produkce florigenu v listech a/nebo s jeho šířením floémem • Experiment s expresí CO a FT pod kontrolou tkáňově specifických promotorů ukázal, že pro urychlení kvetení musí být CO exprimován ve floému, zatímco FT může být exprimován v růz-ných orgánech. Pohybuje se tedy produkt genu FT v rostlině? exprese genů CO a FT v semenáčcích Arabidopsis thaliana (reporterový konstrukt s GUS), Takada a Goto 2003

18. CO a FT – blízko florigenu? • Protein FT fyzicky interaguje s FD, transkripčním faktorem typu bZIP. Jejich komplex aktivuje transkripci genů pro identitu meristému, čímž se indukuje tvorba květů. • Gen FD je exprimován v apikální oblasti stonku, nikoli v listech. Další důkaz, že produkt genu FT se musí šířit rostlinou. exprese genu FD v semenáčcích Arabidopsis thaliana (in situ hybridizace, reporterový konstrukt s GUS, fúzní protein FD s GFP), Abe et al. 2005

19. protein FT jako florigen • 2007: první jasné důkazy, že u Arabidopsis se protein FT šíří floémem do vzrostného vrcholu • Zdálo se, že florigen je po 70 letech identifikován. Další potvrzení bylo ovšem žádoucí. FT ve vzrostném vrcholu Arabidopsis thaliana (rostliny s genovým konstruktem SUC2:FT:GFP ft-7): nahoře: in situ hybridizace mRNA dole: fluorescence fúzního proteinu FT-GFP (Corbesier et al. 2007)

20. protein FT jako florigen • Současně s objevy u Arabidopsis byla publikována práce, dokazující u rýže šíření proteinu Hd3a floémem do apexu. Hd3a je ortolog FT a urychluje kvetení rýže na krátkém dni. • To potvrzuje univerzalitu florigenu – je stejný nebo dosti podobný u různých rostlin, včetně druhů s odlišnými fotoperiodickými reakcemi. • Důkazy pro dálkové šíření proteinu FT byly silné, ale jen nepřímé. Lze detekovat protein FT přímo ve floému? Hd3a (ortolog FT) ve vzrostném vrcholu rýže: lokalizace fúzního proteinu Hd3a-GFP (Tamaki et al. 2007)

21. protein FT jako florigen • Přímý důkaz šíření FT floémem: u krátkodenního druhu tykve Cucurbita moschata jsou dva homology FT (Cmo-FTL1 a Cmo-FTL2) přítomny ve floémovém exudátu při indukční délce dne • ve floémovém exudátu detekován jen protein, nikoli mRNA izotopově značené standardy peptidů peptidy vzniklé štěpením Cmo-FTL2 Hladiny proteinu Cmo-FTL2 ve floémovém exudátu Cucurbita moschata na dlouhém a krátkém dni. Pomocí LC-MS byly stanovovány peptidy specifické pro Cmo-FTL2 (Lin et al. 2007)

22. růst zastaven růst zastaven růst pokračuje růst pokračuje • protein FT jako florigen (a nejen to!) • Homology FT nalezeny u mnoha rostlin (obilniny, listnaté a jehličnaté dřeviny, vinná réva, merlíky, rajčata...). • Kromě kvetení FT patrně reguluje i jiné vývojové reakce, hlavně fotoperiodické. Například u osiky zřejmě kontroluje kvetení a rovněž nástup dormance pupenů, u smrku rašení a nástup dormance pupenů, u bramboru možná tvorbu hlíz. vliv 19-h délky dne na růst letorostů a denní profil hladin CO a FT mRNA u osiky (Böhlenius et al. 2006)

23. Evoluce fotoperiodických reakcí u rostlin • homology nejdůležitějších genů, hlavně CO, byly nalezeny u řady rostlin, včetně mechů • CONSTANS možná ovlivňuje i jiné fotoperiodické reakce než kvetení (např. konstitutivní exprese CO z Arabidopsis potlačuje krátkodenní tuberizaci bramboru) • i v rámci jednoho rodu se nezřídka vyskytují druhy s různými typy fotoperiodické reakce; přechod mezi nimi by tedy měl být poměrně snadný • Atraktivní je proto „modulová“ hypotéza fotoperiodizmu. Předpokládá existenci evolučně konzervativního modulu pro měření délky dne/noci (s hlavní úlohou CONSTANS), který může být spojen s různými moduly pro indukci fotoperiodických procesů (kvetení, tuberizace aj.). Typ fotoperiodické reakce závisí na způsobu interakce těchto modulů (viz různá regulace genu FT proteinem CO u Arabidopsis a rýže). • pro další úvahy týkající se evoluce rostlinného fotoperiodizmu je nezbytné získat spolehlivá data o molekulárních mechanizmech u mnoha druhů