Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

1. Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron

2. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

3. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

4. Le cytosquelette microtubulaire Mitose Interphase

5. Structure des microtubules

6. Assemblage des microtubules • Eléments requis : • Concentration critique, température minimale • Source d’énergie: GTP • Solution adéquate (tampon, magnésium) L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors d’équilibre

7. Oligomères Feuillets Nucléation des microtubules DIMERES MICROTUBULES

8. Elongation de feuillets Elongation des microtubules Addition de dimères

9. - + Instabilité dynamique Treadmilling 50 Longueur (µm) 30 10 0 2000 4000 Temps (s) Etat stationnaire • Consommation d’énergie à l’état stationnaire Flux de sous-unités

10. Mitose Interphase Dynamique des microtubulesin vivo • Une architecture dynamique • Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire • Renouvellement permanent des microtubules • Instabilité dynamique « tempérée » • Treadmilling

11. Contrôle de la stabilité des microtubules • Protéines stabilisant les microtubules • MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4 • Lis1, Doublecortine • XMAP230, XMAP215, TOGp • STOP • Intégrateurs du cytosquelette • Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments) • MACF (microtubules, actine) • Protéines déstabilisantes • Stathmine, SCG10 • XKCM1, Kar3p • Rev

12. Modulation du turnover des microtubules • Protéines liant l’extrémité plus des microtubules • Bim1, EB1, EB2 • Tip1p

13. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

14. Objectifs • Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules • Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules

15. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

16. Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules Mise au point de dosages  Mesure simultanée de - concentration en tubuline-GTP - « masse » de tubuline assemblée - distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne  [Tubuline-GTP](t)  m(t)  l(t)  [MT](t) Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP Pas de système régénérateur du GTP  la tubuline n’assemble qu’une seule fois

17. Vitesse et amplitude augmentent • Symétrie des courbes Réactions d’assemblages • Désassemblage en dessous de la concentration critique

18. Nucléation des microtubules • Vitesse de formation de nouveaux microtubules : • Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP • Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP • Exposant de nucléation : environ 6,2

19. Elongation des microtubules Vitesse d’élongation indépendante de : - concentration instantanée de tubuline-GTP - concentration initiale en tubuline-GTP  Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?

20. Désassemblage des microtubules Des facteurs de catastrophes  des oligomères ? Désassemblage par catastrophes Indépendant de la longueur

21. Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules • Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules •  Des oligomères de tubuline ? • Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules •  Fermeture de feuillets • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe •  Des oligomères facteurs de catastrophes ?

22. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

23. Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules • Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent • Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéré • Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGS • Collecte des fragments de microtubules stabilisés • Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm

24. Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline • Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique • Absence de fragments de microtubules dans les solutions • - filtration 100 nm • - observation en immunofluorescence

25. Diffusion de lumière Microscopie électronique Caractérisation des solutions d’oligomères • Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm) • Des oligomères linéaires

26. Association latérale Association longitudinale Feuillet Structure des oligomères • Liaison de GTP par le dimère de tubuline •  échangeable sur la sous-unité b • Structures possibles des oligomères

27. Propriétés de liaison du GTP par les oligomères Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif  Des oligomères formés par association latérale de dimères Affinité plus faible Echange plus lent  contraintes liées au pontage ?

28.  Exposant de nucléation Concentration en microtubules Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères Tubuline assemblée Longueur moyenne des microtubules

29. Exposant de nucléation  Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule

30. Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation • Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères • 42 nm  environ 10 dimères • Taille + diffusion dynamique de la lumière  65% de tubuline sous forme oligomérique • Exposant de nucléation : environ 4 • 4 oligomères se combinent pour former un microtubule  formation d’un feuillet ? • Les microtubules ne désassemblent pas spontanément • Absence de facteurs de catastrophes ?

31. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

32. Stratégie de recherche de partenaires de la tubuline

33. Partenaires de la tubuline • Un nombre limité de partenaires • Des partenaires variables selon la nature des extraits

34. Protéines identifiées • MAPs et moteurs MAP2, KIF21A • Protéines de la famille EB EB1, EB2 • HSPs HSP70, HSP90 • Enzymes du métabolisme Citrate lyase

35. Efficacité de la méthode • Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire • Identification toujours en cours • Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé) • Grande diversité d’extraits cellulaires possibles • Purification de partenaires interférant avec l ’assemblage • Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage • Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne • Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes

36. Plan • Introduction : le cytosquelette microtubulaire • Objectifs • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules • Conclusions et perspectives

37. Conclusions • Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubules • Nucléation en deux étapes (oligomères ?) • Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes • Facteurs de catastrophes = oligomères? • Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules • Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré • Oligomères formés par association latérale d’environ 10 dimères • Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule • Identification de partenaires de la tubuline • Des partenaires identifiés « qui font sens » • Identifications en cours

38. Perspectives • Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette • Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage • Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères • Recherche de facteurs de catastrophes • Réalisation d’un  « protéome » des partenaires de la tubuline • Transposition aux études cellulaires • Effet des oligomères de nucléation dans les cellules