Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos Replicação, Transcrição e Tradução Gênica

1. Nucleotídeos e Ácidos Nucléicos Replicação, Transcrição e Tradução Gênica UNIOESTE – Curso de Enfermagem – Disciplina de Bioquímica 4ª Aula Teórica – Dia 16/04/2014 Mustafa Hassan Issa

2. 2 Referências da Aula: Livro de Bioquímica do Stryer Capítulos 5, 28 e 29 (5ª Ed.) ou Capítulos 4, 29 e 30 (6ª Ed.)

3. EXPRESSÃO GÊNICA:TRANSCRIÇÃO & PROCESSAMENTO DO RNA+SÍNTESE PROTÉICA 3

4. Processo Geral DNA Proteína RNAm Transcrição Tradução pré-RNAm RNAm Processamento 4

5. TRANSCRIÇÃO&PROCESSAMENTO DO RNA 5

6. 6 Transcrição – Conceitos e Particularidades Processo pelo qual uma molécula de RNA (RNAm) é sintetizada a partir da informação contida na seqüência de nucleotídeos de uma molécula de DNA (Gene). - A Transcrição reflete o estado fisiológico da célula e, portanto, é extremamente variável para atender às suas necessidades.

7. 7 Transcrição – Características Gerais • - Características Gerais: • Complementaridade DNA / RNA; • Substituição TU; • Síntese do RNAm: Sentido 5´3´ (Fita molde de DNA:3´ 5´). • - RNA Polimerase (RNAP): • - Enzima principal do processo de Transcrição, que possui funções e atribuições características; • - Realiza todo o processo: Inicia a reação (sem necessitar dePrimer), realiza o alongamento, e a finalização.

8. 8 Enzima RNAP - Realiza todo o processo: - ReconheceoDNAe liga-se a seqüências específicas → (Replicação: Primase); - Denatura o DNA expondo a seqüência de nucleotídeos a ser copiada → (Replicação: Topoisomerase / Helicase); - Mantém as fitas de DNA separadas na região de síntese da fita de RNAm → (Replicação: SSB); - Renatura o DNA na região imediatamente posterior à da síntese; - Termina a síntese do RNAm.

9. 9 RNAP – Sentido da Ação Enzimática - Reação ocorre entre a Hidroxila (-OH)da extremidade 3’ de um Ribonucleotídeo com o Grupo Trifosfato (-(3)PO4-) ligado ao Carbono 5’ do Ribonucleotídeo a ser incorporado; - Sentido da Transcrição: Da mesma forma como ocorre para a Polimerização do DNA (DNA Polimerase), ou seja, sentido: 5´3´.

10. RNAm RNAm 5’ 5’ U = A U = A porção 3’ livre 3’ 3’ DNA - Fita Molde DNA - Fita Molde 5’ C = G C = G = = 5’ RNAP: sentido da síntese 3’ 3’ - Síntese da fita de RNAm: Reação de formação de ligações fosfodiéster no sentido 5´ para 3´ da nova fita de RNAm catalisada pela Enzima RNAP. 10 RNAP – Processo de Transcrição

11. 11 Transcrição - Ação da RNAP:Fases 1.INÍCIO: - Reconhecimento de sequências específicas no DNA (Gene) que indicam o início do processo. 2.ALONGAMENTO: - Incorporação dos Ribonucleotídeos (RNAm). 3.TÉRMINO: - Reconhecimento de sequências específicas no DNA (Gene)que indicam o final da síntese – Interrupção do processo (Final da Síntese do RNAm).

12. RNAm: Sequência de nucleotídios de RNA que é correspondente a um gene no DNA. 12 Complementaridade entre RNAm e DNA

13. 13 Transcrição – Fases (1. Início) - O DNA apresenta sequências específicas (regiões), denominadas “Promotoras” que sinalizam exatamente onde a síntese do RNAm deve ser iniciada (dirigem o processo); - As Regiões Promotoras são reconhecidas pela RNAP por sequências determinadas de Nucleotídeos na fita molde de DNA; - Na célula eucarionte: São posicionadas a -75 e a -25 Nucleotídeos upstream (antecedente) ao primeiro Nucleotídeo a ser transcrito.

14. DNA molde Trecho “TATA” (“Hogness box”) Trecho “CAAT” (às vezes presente) Começo do RNAm 14 Transcrição – Fases (1. Início) - No Trecho -75 ocorre: (3´) GGNCAATCT (5´); - No Trecho -25 ocorre: (3´) TATAAA (5´); - Devido as características do Trecho -25 a Região Promotora também é denominada: “TATA Box”; - O primeiro Nucleotídeo no DNA a ser transcrito é denominado +1 (posição +1). 3’ 5’ 5’ 3’

15. 15 Transcrição – Fases (2. Alongamento) - Síntese do RNAm: A partir da “Posição +1” do gene, forma-se uma porção mista de DNA/RNAm (17 Nucleotídeos) denominada “Bolha de Transcrição”; - A RNAP desliza ao longo da fita molde de DNA estendendo uma nova fita de RNAm crescente no Sentido: 5’ 3’ através da adição de Ribonucleotídeos presentes no núcleo da célula (Energia: Ribonucleotídeos -(3)PO4-); *Obs: Velocidade/segundo - RNAP: 50 Ribonucleotídeos /DNAP:800 Desoxirribonucleotídeos.

16. 16 Transcrição – Fases (3. Término) - O processo ocorre até a RNAP encontrar a porção de término do alongamento caracterizada por repetições “GC” seguidas de repetições “AT” no DNA; - Após esta porção ocorre uma seguinte com 4 ou mais Adeninas (resultarão numa sequência com Uracilas na porção 3’ do RNAm); - O RNAm (pré-RNAm) formado desliga-se do filamento do DNA (Gene) que posteriormente é renaturado em fita dupla.

17. Dupla Hélice de DNA DNA desenrolado (17 bp abertas) RNA Polimerase RNA Polimerase Filamento Codificante Filamento Molde Reenrolamento Desenrolamento Ponto de alongamento Hélice Hibrida RNA-DNA RNA Nascente Movimento da RNAP 17 Transcrição do DNA

18. 18 Transcrição – Processamento do RNAm - Os RNAm sintetizados inicialmente no processo de Transcrição são chamados Transcritos Primários (pré-RNAm); - Esses Transcritos ainda não representam a sequência madura, ou seja, NÃO correspondem à forma final do RNAm funcional (a ser traduzido no citoplasma) e necessitam de modificações (pelo menos nas pontas 5’ e 3’). - Processamento do RNA (modificações): 1) Capeamento (Cap 5’); 2) Poliadenilação (Cauda poli-A 3’); 3) Processo de “Splicing”.

19. 19 Transcrição – Processamento do RNAm 1)Capeamento: Logo após o início da Transcrição da molécula do RNAm é adicionado um Ribonucleotídeo de Guanina Metilado à sua extremidade 5’. Este resíduo é chamado de “Cap” (Capuz ou Cap 5’); 2)Poliadenilação: Uma seqüência (dezena / centena) de resíduos de Ribonucleotídeos de Adenina (Adenilatos) são adicionados a extremidade 3’, sendo chamada de Cauda poli-A(AAAAAAAA). *Obs: São adicionados à molécula no processo de Transcrição (portanto não são codificados pelo DNA).

20. 20 Transcrição – Processamento do RNAm - Importância do Capeamento e da Poliadenilação: 1) Proteger as extremidades 5’ e 3’ do pré-RNAm da ação de exonucleases (RNAses); 2) Conferem estabilidade à molécula recém-formada; 3) Utilizados para reconhecimento pelo Ribossomo de que se trata de um RNAm a ser traduzido; 4) Colaboram para indicar o início e final da Tradução gênica. *Obs: Uma seqüência AAUAAA (no pré-RNAm), localizada a pelo menos 50 nucleotídeos “upstream” ao sítio de poliadenilação é o sinal de que a molécula está terminando e que deve ser adicionada a Cauda poli-A.

21. 21 Transcrição – Processamento do RNAm 3) Processo de Splicing: Após a adição do “Cap” 5’ e da Cauda poli-A 3’, o pré-RNAm pode sofrer o processo de excisão dos Íntrons e junção dos Éxons, mecanismo conhecido como “splicing” (Recomposição) e migra para o citoplasma da célula para ser traduzido no Ribossomo; - Os Íntrons (Sequencia Intercalar) são as regiões de DNA constitutivas dos genes e os Éxons (Sequencia Expressa) as regiões que verdadeiramente codificam as proteínas. *Obs: Spliceossoma: Ambiente no qual os snRNA (small nuclear RNA) reconhecem os limites entre os éxons e os íntrons e catalisam o processo do Splicing do pré-RNAm.

22. 22 Processamento do RNAm – Processo de “Splicing” - RNA maduro = Segue ao citoplasma após processo de “splicing” e corresponde aosÉxons+Cap 5’+Cauda poli-A 3’.

23. 23 Transcrição – Sinalização no DNA

24. Bioquímica do Gene – Regiões Codificadoras e Não-Codificadoras do DNA O DNA é formado por 2 regiões: Intergênicas Gênicas Intergênicas Gênicas Região Intergênica Porção regulatória, que sinaliza o início ou o final de um gene, e influencia a transcrição gênica, ou é o ponto de início para a replicação do DNA Região Gênica Porção que codifica um RNAm (proteína), composta pelos Éxons e Íntrons 24

25. SÍNTESE PROTÉICA(TRADUÇÃO) 25

26. 26 Tradução • -A Tradução é um processo que tem por base a seqüência do RNAm originada do núcleo celular (RNAm maduro) para determinar os Aminoácidos de uma nova sequência polipeptídica (Proteína), codificada na forma de Códons (trinca de nucleotídeos no RNAm); • - Moléculas de RNAt (RNA Transportador) reconhecem estes Códons e transferem (no Ribossomo) Aminoácidos a uma nova sequência polipeptídica; • - A informação para a constituição desta sequência polipeptídica estava contida num Gene (a informação foi “enviada do núcleo” sob a forma de RNAm).

27. 27 Codificação Genética - Código Genético: Relação entre a sequência de bases no DNA e a sequência correspondente de aminoácidos na proteína; - O código genético encontra-se na forma de “triplets” (trincas) – Os Códons no RNAm; - Ao total, são 64 diferentes RNAt (possuem os Anti-Códons) que podem codificar os 20 aminoácidos.

28. 28 RNA Transportador (RNAt)

29. - Os Códons (no RNAm) para o RNAt - 64 Códons possíveis / 20 aminoácidos. 2ª Base no Códon 3ª Base no Códon 1ª Base no Códon 29 Codificação Genética

30. 30 Tradução - O Códon AUG, que codifica o aminoácido Metionina, é o Códon de iniciação no RNAm de todas as células eucariontes; - O RNAtMet (Anti-Códon:UAC) reconhece o primeiro Códon AUG(localizado no primeiro Éxon próximo à ponta 5’ da sequência do RNAm), e insere o aminoácido Metioninano início da nova cadeia polipeptídica em formação.

31. 31 Tradução - Durante a síntese protéica o Ribossomo desloca-se ao longo do RNAm: Possibilitando um pareamento entre o RNAm com os RNAt que carregam os diferentes aminoácidos para compor as novas proteínas; - O Ribossomo desloca-se ao longo do RNAm, no sentido 5’  3’, permitindo a síntese da proteína do sentido amino-terminal para carboxi-terminal; - ORibossomo orienta e direciona o crescimento da cadeia polipeptídica (eficiência da tradução).

32. 32 Tradução - O final do processo de síntese de proteínas no Ribossomo ocorre pelo aparecimento de um dos 3Códons de Terminação (localizado no último Éxon próximo à porção 3’) da sequência do RNAm: 1)UAA 2) UAG 3) UGA

33. 33 Ribossomo (RNAr): RNAm / RNAt

34. G C A T T A C G 34 Transcrição RNA Polimerase Gene sendo transcrito 5’ 3’ 3’ A T G G C T A C C G A T AU G C 3’ 5’ 5’ C Filamento de DNA molde GG A U Sequencia de RNAm nascente

35. Gly aa livre Ribossomo His Proteína Met Ala Cys Phe Asp Glu tRNA 5’ 3’ A U GG C AU G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A Sequencia de mRNA (maduro) códon Anticódon: Met:UAC Ala:CGU Cys:ACG Direção do avanço do ribossomo 35 Tradução

36. Gly His Phe Glu Asp Met Ala Cys 5’ 3’ A U G G C AU G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A Anticódon: Ala:CGU Cys:ACG 36 Tradução

37. Gly His Met Ala Cys Asp Glu Phe 5’ 3’ A U G G C A U G CG A C G A A U U C G G A C A C A U A Anticódon: Cys:ACG Asp:CUG 37 Tradução

38. His Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly 5’ 3’ A U G G C A U G C G A CG A A U U C G G A C A C A U A Anticódon: Asp:CUG Glu:CUU 38 Tradução

39. Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A AU U C G G A C A C A U A Anticódon: Glu:CUU Phe:AAG 39 Tradução

40. Lys Gly His Ile 40 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U CG G A C A C A U A Anticódon: Phe:AAG Gly:CCU

41. His Ile Lys 41 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G AC A C A U A Anticódon: Gly:CCU His:GUG

42. Ile Lys 42 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His 5’ 3’ A U G G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A CA U A Anticódon: His:GUG Ile:UAU

43. Lys Leu 43 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile 5’ 3’ G C A U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U AA A A Anticódon: Ile:UAU Lys:UUU

44. Leu Met 44 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys 5’ 3’ U G C G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A AU U A Anticódon: Lys:UUU Leu:AAU

45. Met Asn 45 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu 5’ 3’ G A C G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U AA U G Anticódon: Leu:AAU Met:UAC

46. Asn Pro 46 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met 5’ 3’ G A A U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U GA A C Anticódon: Met:UAC Asn:UUG

47. Pro Gln 47 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn 5’ 3’ U U C G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A CC C A Anticódon: Asn:UUG Pro:GGU

48. Gln 48 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro 5’ 3’ G G A C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C AC A A Anticódon: Pro:GGU Gln:GUU

49. 49 Tradução Met Ala Cys Asp Glu Phe Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ 3’ STOP C A C A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A AU A A Anticódon: Gln:GUU STOP:AUU

50. 50 Tradução Ala Cys Asp Glu Phe Met Gly His Ile Lys Leu Met Asn Pro Gln 5’ 3’ STOP A U A A A A U U A A U G A A C C C A C A A U A AT A C Anticódon: STOP:AUU