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Northern Blot

Mauro Almeida LCB . Northern Blot.

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Northern Blot

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Presentation Transcript

  1. Mauro Almeida LCB NorthernBlot

  2. NorthernBlot é uma técnica muito utilizada na área da biologia molecular, para o estudo da expressão génica. No fundo queremos determinar quando e onde um determinado gene é expresso. NorthernBlot permite que investigadores determinem o peso molecular de um mRNA e que meçam as quantidades relativas do mRNA presente em diferentes amostras. É uma técnica muito semelhante ao Southern Blot. NorthernBlot

  3. 1) RNA (quer de RNA total ou apenas mRNA) é separado por eletroforese em gel, normalmente num gel de agarose. Como há tantas moléculas de RNA diferentes sobre o gel, normalmente aparece como uma mancha, em vez de bandas discretas (as moléculas de RNA devem ser desnaturadas através da adição de formaldeído ou outro desnaturante químico ao tampão de eletroforese). 2) O RNA é transferido para uma membrana especial, designada nitrocelulose, embora outros tipos de membranas, podem ser utilizadas. As moléculas de RNA retêm o mesmo padrão de separação que tinham no gel. O RNA é imobilizado por irradiação UV. Passos da técnica

  4. 3) A membrana é incubada com uma sonda de DNA que é de cadeia simples. Esta sonda irá formar pares de bases, com sua seqüência de RNA complementar e se ligam para formar uma molécula de RNA-DNA de dupla cadeia. A sonda só pode ser vista, se for marcada radioativamente ou com uma enzima ligada a ela (por exemplo, fosfatase alcalina ou peroxidase de rábano). 4) A localização da sonda é revelada por incubação com um substrato incolor que a enzima converte aneandoa um produto colorido, que pode ser vista, ou emite luz que irá expor filme de raios-X. Se a sonda foi marcada com radioatividade, pode expor-se no filme de raios-X diretamente. Passos da técnica

  5. Na técnica de Southern Blot são efetuadas transferências de DNA, enquanto que nesta as transferências são de RNA. As moléculas de RNA são muito sensíveis à degradação por RNases. NorthernblotvsSouthernblot

  6. Comparação de tecidos normais com tecidos cancerígenos. Esta técnica vai permitir ativar os oncogenes para mostrar a sua sobre expressão, mas também a baixa regulação dos genes supressores tumorais. Isto permite aos cientistas determinar quais os tipos de proteínas que são produzidas por examinação de diferentes expressões ao nível de mRNA. Aplicação biomédica

  7. http://www.bio.davidson.edu/courses/genomics/method/northernblot.html (accessed 15 May 2013) http://www.youtube.com/watch?v=KfHZFyADnNg (acessed 15 May 2013) http://www.biotecharticles.com/Biotechnology-products-Article/Technique-of-Northern-Blotting-382.html (acessed 15 May 2013) SNUSTAD, D. P.; SIMMONS, M. J. Fundamentos de genética. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008. Bibliografia

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