In situ Hibridizasyon ISH, FISH, GISH, CGH

1. In situ Hibridizasyon (ISH, FISH, GISH, CGH) Fatma Elif �epni, Aslihan Temel, N. �zer Senol, Baris Eren, Murat Pekmez, �zg�r �akir

2. In situ Hibridizasyon (ISH)

3. Tek bir nukleusla temsil edilen farkli t�rlerden k�ken alan kromozomlarin ayirimina dayanan bir y�ntemdir. Somatik hibritlerin mayozu ve geri �aprazlama sonucu elde edilen hibritlerin �alisilmasinda kullanilabilir. Uygulama alani genellikle hibritlerdeki ebeveynlerin kromozom analizidir. �ok sayida dogal alloploid hibritlerde ve t�rler arasi hibritlerde kullanilmistir. �R: domates-patates (Jacobsen et al. 1996), Allium cepa- A. fistulosum (Khrustaleva and Kik, 1998), Alstroemeria aura- A. inodora (Kamstra et al. 1999)�

4. FISH Molek�ler sito-genetikteki hizli ilerlemeler, bantlama ve boyama tekniklerinin hizli gelisimiyle saglanmistir. Standart bantlama teknikleri yalnizca bir denemede bir h�cre i�in t�m genomu sorgulamada yetersiz kalmaktayken, Fluoresan in situ hibridizasyon (FISH), genleri ve kromozomlari boyamada fluoresan molek�llerin kullanildigi bir y�ntem olarak bantlama teknikleriyle birlikte iyi bir degerlendirme aracidir.

6. FISH Fluoresan isaretleme, in situ hibridizasyon prensibine g�re, prob ve �rnek arasinda melez bir yapi meydana gelmesiyle sinyale d�n�sen bir islemdir. FISH, Southern blot tekniginin analogudur. FISH, fluoresan isaretlerle etiketlenen, tamamlayici DNA�ya, bu DNA dizilerinin yerlesimini g�rebilmek i�in hibridizasyona ugrayan veya baglanan tek zincirli DNA (prob) kisa dizilerini gerektiren bir y�ntemdir.

7. FISH Bu y�ntem gen haritalanmasinda ve kromozom aberasyonlarinin tanimlanmasinda kullanilir. Kromozomlarin �alisilmasinda kullanilan bir�ok teknik, aktif olarak b�l�nen h�creleri gerektirirken (metafaz kromozomlari), FISH ayni zamanda b�l�nmeyen h�crelere de uygulanabilir (interfaz nukleusu). Metafaz delesyonlari belirlemede kullanilir Interfaz genelde kromozomlarin yeniden d�zenlenmesinin ve kromozom sayilarinin belirlenmesinde kullanilir.

9. FISH Prob hazirlama

10. FISH �Whole chromosome� problari, herbiri t�m bir kromozom boyunca farkli dizilerle hibridizasyona girebilen k���k problarin kolleksiyonudur. Bu sekildeki bir prob kitapligi taranarak t�m bir kromozom spektral bir karyotip olusturmak �zere boyanabilir. Bu teknik kromozomal translokasyonlarin tanimlanmasinda imakan saglar FISH ile sitogenetik �alismalara yardimci olan ve iyi tanimlanmis uygulamalar gelistirilmis olmasina ragmen, amaca uygun prob ve filtre se�imi dogru yapilmaz ise hatali ve zaman alici denemeler ortaya �ikmaktadir

11. FISH Prosed�r Metafaz kromozomlari veya interfaz nukleusu kullanilarak preparatlarin hazirlanmasi Etanol i�inde dehidrasyon DNA�yi 70oC�de denat�re etme Etiketli probun denat�rasyonu Hibridizasyon i�in 37oC�de, 4-16 saat ink�basyon

12. FISH

13. FISH Spektral Karyotipleme Herbiri 5 florokromun farkli kombinasyonlariyla hazirlanmis problarin 24 kromozomla hibridizayounu ve tek bir filtreye sahip fl�oresans mikroskobu ile analizine dayalidir. Kansere neden olan genomik degisikliklerin standart bantlama y�ntemlerinden daha iyi anlasilmasini saglar. M-FISH (Multicolor FISH) 5 florokromun �esitli kombinasyonlariyla hazirlanmis problarin hibridizasyonu ve farkli flouresans sinyalleri ile analizine dayali bir y�ntemdir.

14. FISH COBRA-FISH Diger FISH y�ntemlerine benzer. Ancak 4 florokrom kullanilir. 24 kromozomun 12si bir gruba diger 12si diger gruba ayrilir. Ilk grup 3 florokromla hibridlestirilirken, 2. gruba ek olara d�rd�nc� florokrom uygulanir. Bu metod, 5. florokrom i�in, kollara �zg� boyama veya M-FISH ile locus-specific proba ge�is i�in kullanilmistir. R x FISH Gibbon kromozomlarinin prob olarak kullanilir. Gibbon ve insan kromozomlarinin homolojisi yaklasik % 98 dir. RxFISH ile yalnizca kromozom arasi par�a degisimleri degil, ayni zamanda kormozom i�i degisimler de belirlenebilmektedir. (delesyon, inversiyon). G-bantlama teknigi ile birlikte kullanildiginda 400 kat daha hassas sonu�lar vermektedir.

19. FISH Kullanimdaki faydalari Hizli Hibridizasyon ve belirleme i�in y�ksek etkinlik Bir�ok h�cre analiz edilebilir Replikasyon ge�iren h�crelerin kullanilmasi gerekmez

20. FISH Kullanimdaki sinirlamalar Probun uygun olmasi ve dogru probun eldesi i�in nelere bakilmasi gerektiginin iyi bilinmesi Hibridizasyon i�in birlesme sinyali Nuklear organizasyonda beklenmedik varyasyonlar

22. CGH (Karsilastirmali Genomik Hibiridizasyon)

23. iki renkli g�r�nt�leme sistemi kullanilmasi sonucunda kromozom anomalilerinin daha g�venilir saptanmasi Az miktarlarda DNA �rneginin yeterli olmasi Test �rnegi i�in metafaz kromozomlari gerekli degil Kati t�m�rlerin �alisilmasinda da elverislidir.