APLICAREA UNOR TEHNICI MOLECULARE PENTRU IDENTIFICAREA SPECIILOR DE FUSARIUM SI A CHEMOTIPULUI

1. APLICAREA UNOR TEHNICI MOLECULARE PENTRU IDENTIFICAREA SPECIILOR DE FUSARIUM SI A CHEMOTIPULUI Prof.dr.Petruta Cornea

2. Identificarea şi caracterizarea rapidă a tulpinilor de Fusarium izolate din diverse surse (de pe plante, din sol, materii prime sau produse alimentare) reprezintă o cerinţă importantă a cercetărilor ce vizează detectarea capacităţii micotoxigene a acestora. Cercetările efectuate până în prezent la nivel internaţional au avut drept scop, pe de o parte, stabilirea unor markeri moleculari specie-specifici şi, pe de altă parte, identificarea genelor implicate în biosinteza micotoxinelor. Pornind de la aceste gene se urmăreşte stabilirea unor markeri moleculari asociaţi fie unui anumit tip de micotoxină fie pentru determinarea potenţialului micotoxigen, fără a fi necesară dozarea cantitativă a micotoxinelor.

3. In ciuda studiilor intense asupra producerii de micotoxine de către fusarii, calea de biosinteză a acestora nu este pe deplin elucidată (Kimura şi colab., 2006)

4. Pe baza producerii de tricotecene, tulpinile de F.graminearum au fost încadrate în două chemotipuri: chemotipul DON ce cuprinde tulpini care sintetizează DON şi acetil-DON; chemotipul NIV, ce cuprinde tulpini ce sintetizează NIV şi 4-ANIV. Studiile legate de distribuţia geografică a respectivelor chemotipuri au arătat că există unele diferenţe: chemotipul NIV a fost raportat în unele ţări din Africa, Asia şi Europa (Lee şi colab., 2001) în timp ce în America de Nord el nu a fost evidenţiat. Deoarece chemotipul NIV ridică o serie de probleme datorită toxicităţii, găsirea unor modalităţi de evidenţiere rapidă a capacităţii de producere a respectivelor micotoxine reprezintă o direcţie importantă de studiu.

5. In privinţa genelor implicate în biosinteza acestora există o serie de lacune legate nu numai de identificarea genelor ci şi de stabilirea funcţiilor lor. • Până în prezent, se consideră că cele mai importante gene implicate în biosinteza tricotecenelor şi a căror funcţie a fost stabilită sunt: Tri 3 pentru enzima 15-O-acetiltransferaza, Tri 4 şi Tri 11 ce codifică pentru douuă P450 oxigenaze, Tri 6 pentru un factor de transcriere, Tri 5 pentru trichodien-sintetaza, Tri 10 care este o genă reglatoare, Tri 12 care determină sinteza unei pompe pentru efluxul de tricotecene, Tri 9 pentru o proteină cu funcţie necunoscută. La acestea se adaugă gena Tri7 (ce codifică sinteza 3-acetiltricotecen 4-O-acetiltransferaza şi gena Tri13 ce codifică enzima 3-acetiltricotecen C-4 hidroxilaza, gene propuse ca marker pentru determinarea chemotipului.

6. Kimura şi colab.(2007) au comparat grupul de gene (clusterul) Tri5 implicat în biosinteza tricotecenelor la Fusarium sporotrichoides şi la diverse chemotipuri de F.graminearum, evidenţiind rolul fiecărei gene din acest grup. Cercetările efectuate au arătat că, în cazul grupului (clusterului) Tri5 există un grad înalt de conservare structurală şi funcţională între cele două specii de Fusarium menţionate. La nivelul clusterului Tri5 de la tulpinile producătoare de tricotecene de tip A sau de tip B (deoxinivalenol = DON, nivalenol = NIV sau derivaţii acetilaţi ai acestora) există alte 11 gene Tri, notate: Tri4, Tri3, Tri6, Tri11, Tri12, Tri7, Tri10, Tri13, Tri8, Tri9, Tri14, acestea fiind supuse unui proces de reglare care determină o creştere a cantităţii de micotoxine (upregulation) (fig.2). Rolul acestor gene a fost stabilit în cea mai mare parte: unele codifică enzime de tipul sintetazelor (Tri5), oxigenazelor (Tri4, Tri11), factor de transcriere (Tri6), acetiltransferază (Tri3), pompa de eliminare a toxinelor (Tri12) etc.

7. Clusterul Tri5 implicat în biosinteza tricotecenelor la diferite specii de Fusarium

8. Interesul pentru desemnarea unor primeri specifici care să permită diferenţierea între tulpinile aparţinând aceleiaşi specii, în privinţa capacităţii de a produce micotoxine, a determinat examinarea diverselor gene incluse în clusterul Tri5. Primele cercetări s-au îndreptat asupra genei Tri5 care codifică pentru sinteza tricodien sintetazei, enzimă ce catalizează prima etapă a căii de biosinteză a tricotecenelor. Astfel, Niessen şi Vogel (1998) au propus o pereche de primeri, notaţi tox5-1/tox5-2 şi care corespund unei secvenţe conservate din această genă (prezentă la mai multe specii de Fusarium), cu o lungime de 658 pb. Detectarea unui asemenea produs de amplificare permite concluzia că tulpinile testate sunt producătoare de tricotecene, fără a se putea însă preciza tipul micotoxinei. Mai recent, Nicholson şi colab. (2004) au propus pentru detectarea producătorilor de tricotecene, utilizarea unei alte perechi de primeri, notată Tri5F/Tri5R, aceasta permiţând obţinerea unui amplicon de 545 pb.

9. O altă genă luată în discuţie este Tri6 care codifică sinteza unei proteine reglatoare - un factor de transcriere cu zinc („zinc finger transcription factor”), gena fiind plasată în faţa (amonte) genei Tri5. Gena respectivă este lipsită de introni, iar deleţiile de la nivelul ei sunt asociate cu reducerea sau chiar eliminarea capacităţii de a produce micotoxine. Pornind de la aceste informaţii, Bakan şi colab. (2002) au propus două perechi de primeri, notaţi 4056/3551, respectiv N1-2/N1-2R prin a căror utilizare s-ar putea face distincţie între tulpinile de Fusarium culmorum capabile să producă cantităţi reduse sau, din contră, crescute de tricotecene (DON). Desemnarea respectivilor primeri s-a bazat pe determinarea secvenţei de nucleotide a unei secvenţe de 550 pb din gena Tri5 de la mai multe tulpini înalt producătoare de DON, respectiv slab producătoare, precum şi pe examinarea regiunii intergenice tri5-tri6. Deşi nu se dau detalii legate de localizarea primerilor desemnaţi, autorii evidenţiază faptul că utilizarea perechii de primeri N1-2/N1-2R permite obţinerea unui produs de amplificare de aprox.200pb doar în cazul tulpinilor înalt producătoare de DON, în timp ce folosirea perechii de primeri 4056/3551 se obţine un produs de amplificare de.650 pbdoar în cazul tulpinilor ce produc o cantitate redusă de DON.

10. Lee şi colab.(2001) propun pentru diferenţierea între tulpinile de tip DON şi cele NIV utiliyarea genei Tri7 ce codifică sinteza 3-acetiltricotecen 4-O-acetiltransferaza de la diversele tulpini de F.graminearum. Proteina codificată de gena Tri7 nu este necesară pentru sinteza DON dar este necesară pentru acetilarea grupării C4 a NIV pentru a-l converti la 4-ANIV, astfel că tulpinile aparţinând chemotipului NIV pot produce atât NIV cât şi 4-ANIV. • Comparând secvenţa de nucleotide a genei Tri7 de la tulpini cunoscute a fi producătoare de DON cu cea ce la tulpini producătoare de NIV, s-a evidenţiat faptul că, între ele există o diferenţă de lungime datorată prezenţei mai multor repetiţii în tandem a unei secvenţe de 11 pb (CACAATATTAG), localizate la nivelul unui intron din interiorul genei de la tulpinile producătoare de DON. Astfel, folosindu-se primeri specifici pentru această genă, Lee şi colab.(2001) au obţinut un unic produs de amplificare, de 161 pb, în cazul tulpinilor producătoare de NIV şi tot câte un amplicon pentru cele producătoare de DON, dar cu dimensiuni mai mari, datorate unor copii repetate ale secvenţei de 11 pb (amplificate de până la 16 ori), astfel că ampliconii pot varia ca dimensiune între 172pb şi 327pb.

11. Wang şi colab.(2008) au propus o abordare similară pe baza genei Tri13 ce codifică enzima 3-acetiltricotecen C-4 hidroxilaza care poate fi considerată ca fiind determinantă pentru stabilirea chemotipului DON, respectiv NIV la F.graminearum. • Tulpinile aparţinând chemotipului NIV conţin genele Tri7 şi Tri13 funcţionale, în timp ce la tulpinile incluse în chemotipul DON cele două gene sunt nefuncţionale. • Analiza comparativă a secvenţei de nucleotide a genei Tri13 a evidenţiat că secvenţele eliminate din această genă par a fi asociate cu poziţia acetilării chemotipurilor DON, alături de asocierea cu conversia DON-NIV. Utilizând o unică pereche de primeri, Tri13P1 (5′-CTC SAC CGC ATC GAA GAS TCT C-3′) şi Tri13P2 (5′-GAA SGT CGC ARG ACC TTG TTT C-3′) s-au obţinut produşi de amplificare de dimensiuni diferite, asociaţi cu tipul de micotoxină produs: fragment de 583 pb pentru producătorii de 15-AcDON, fragment de 859 pb pentru producătorii de NIV şi un fragment de 644 pb pentru tulpinile ce produc 3-AcDON. Cei trei ampliconi distincţi ce diferă în funcţie de chemotip sugerează că fiecare chemotip conţine cel puţin o parte conservată din gena Tri13, la chemotipul NIV existând gena intactă, funcţională, produsul de amplificare având 859 pb. In cazul tulpinilor producătoare de DON, gena Tri13 conţine deleţii de lungimi diferite: chemotipul 3-AcDON conţine două deleţii, una de 178 pb, iar cealaltă de 37 pb, localizate între regiunile recunoscute de primerii folosiţi, astfel că produsul de amplicare are 644 pb; chemotipul 13-AcDON prezintă în plus faţă de cele două deleţii menţionate deja, încă una, de 61 pb, ceea ce face ca produsul de amplificare rezultat cu aceiaşi primeri să fie de 583 pb.

13. Cercetările efectuate în laboratorul de biologie moleculară al Biotehnol au vizat: • Identificarea moleculară a speciilor cărora le aparţin izolatele de Fusarium furnizate de dna.dr.Mariana Ittu de la ICDA Fundulea; • Stabilirea pe baza unor markeri moleculari a chemotipului izolatelor de F.graminearum identificate.

14. MATERIALE SI METODE • Materialul biologic a fost reprezentat de 75 tulpini de Fusarium, dintre care 70 izolate noi şi 5 tulpini caracterizate anterior, considerat ca tulpini de referinţă. • Izolarea ADN s-a realizat pe baza unei metode optimizate în laboratorul nostru, ea presupunând un tratament al miceliului cu un amestec de enzime hidrolitice de la Helix pomatia (“snail juice”) urmat de liza mecanică a acestuia, deproteinizare şi, în final, precipitatea ADN cu etanol.

15. Identificarea moleculară a tulpinilor de Fusarium. Pentru aceasta a fost realizată o reacţie de amplificare de tip multiplex, folosind trei perechi de primeri, specifici pentru F.gramiearum, F.culmorum şi F.sporotrichoides. Reacţia PCR s-a realizat cu ajutorul unui Termocycler M.J. Research şi a kitului Promega corespunzător. Amestecul de reacţie cuprinde următoarele componente: apa deionizată, tampon 1x, dNTP 1,25 mM, primeri - câte 0,2 M din fiecare, MgCl2 2,5 mM, Taq polimeraza 2U/25 l, ADN fungic matriţă 20 ng, la un volum total de 25l. Condiţiile de amplificare au fost următoarele: 92oC – 4 min; (92oC – 1 min; 60oC – 1 min; 72oC – 2 min) – 35 cicluri; 72oC – 10 min.

16. Detectarea moleculară a capacităţii micotoxigene a noilor izolate a fost realizată prin folosirea mai multor perechi de primeri, fie în reacţii PCR individuale, fie în reacţii de tip multiplex. Amplificarea probelor s-a realizat într-un volum de 25 μl, incluzând următoarele componente în concentraţie finală: tampon de reacţie 1x, 0,2 mM deoxinucleotide, 0,4µM fiecare primer, 1,5 mM MgCl2 , 1U de enzimă Taq polimeraza Promega şi 50 ng din ADN matriţă. Probele astfel pregătite au urmat următorul program de amplificare: denaturare iniţială 94º C - 4 min, urmată de 35 cicluri: 94ºC - 1 min.; 58 ºC - 40 sec., 72ºC - 40 sec şi o extensie finala de 6 min la 72ºC. Evidenţierea produşilor s-a realizat pe gel de agaroză (2,%) şi colorare cu bromură de etidiu. Drept markeri de migrare s-au utilizat markerii 100pb Plus DNA Ladder de la Fermentas şi cei de 100pb DNA ladder de la Roth. Analiza produşilor de amplificare s-a realizat prin electroforeză în gel de agaroză 1,5%, urmată de vizualizarea în lumină UV a benzilor colorate cu EtBr (folosind sistemul BioDocIt UVP)

18. REZULTATE SI DISCUTII Pentru stabilirea speciei căreia îi aparţin izolatele de Fusarium, în experimentele efectuate au fost testat trei perechi de primeri, într-o reacţie multiplex, optimizând condiţiile de amplificare. Pentru validarea rezultatelor, în reacţiile de amplificare au fost folosite şi două tulpini de Fusarium de colecţie, tulpini a căror identitate este sigură: o tulpină de F.culmorum şi una de F.graminearum. Rezultatele obţinute au evidenţiat că majoritatea tulpinilor analizate aparţin speciei F.graminearum şi doar o mică parte (aproximativ 5%) speciei F.culmorum.

19. Profilul electroforetic al produşilor de amplificare rezultaţi prin utilizarea, în reacţia PCR multiplex, a perechilor de primeri FC01F/FC01R şi Fg16F/Fg16R. Ordinea tulpinilor este următoarea: 1 – 30; 2 – 46; 3 – 54; 4 – 58; 5 – 92; 6 – 96; 7 – 111; 8 – 145; 9- 273; 10 – 279; 11- 325; 12 – 382; 13 – 387; 14 – 8713; 15 – Fc; 16 – Fg. 550 pb 450 pb

20. Aspecte similare au fost obținute și în cazul testării noilor izolate de Fusarium. Astfel, au fost analizate doar 27 dintre tulpini, pentru trei dintre ele condițiile de cultivare nu au fost potrivite pentru obținerea miceliului. Dintre acestea, una singură aparține speciei F.culmorum (tulpina notată 1056 (2-1) GRIF 2/28), restul aparținând speciei F.graminearum.

21. In cazul altor 40 de izolate analizate, doar două au fost identificate ca F.culmorum, două izolate nu au dat produşi de amplificare (probabil datorită calităţii slabe a ADN izolat), iar restul de 36 izolate au fost identificate ca fiind F.graminearum

22. Examinarea potenţialului micotoxigen, la nivel molecular, al tulpinilor de Fusarium izolate • Pentru detectarea capacităţii tulpinilor analizate de a produce tricotecene a fost utilizată o pereche de primeri specifici pentru gena Tri5(tox5-1/tox5-2) care ar trebui să producă un amplicon de 650 pb la tulpinile producătoare. La majoritatea tulpinilor analizate a fost evidenţiat ampliconul de aprox.650 pb, excepţie făcând tulpinile F9 şi F30. Prezenţa acestui produs de amplificare sugerează capacitatea tulpinilor respective de a produce tricotecene, fără a se putea preciza, în absenţa dozărilor biochimice, tipul de tricotecene sintetizat (stabilirea chemotipului).

23. In cazul tulpinilor de F.graminearum a fost examinată posibilitatea detectării diferenţelor dintre tulpini în privinţa nivelului de producere de tricotecene. In etapa anterioară au fost testate două perechi de primeri, N1-2/N1-2R pentru tulpinile înalt producătoare de tricotecene şi 4056/3551 pentru cele slab producătoare, rezultatele obţinute pe tulpini de referinţă fiind promiţătoare în ceea ce priveşte acurateţea. De aceea, am continuat testarea acestor primeri şi pentru noile izolate de F.graminearum printr-o reacţie multiplex, folosind simultan cele două perechi de primeri. Rezultatele obţinute evidenţiază prezenţa unui amplicon cu o dimensiune apropiată de 200 pb la o parte a tulpinilor analizate, ceea ce ar sugera faptul că acestea sunt înalt producătoare de micotoxine.

24. Pentru a putea determina şi tipul de micotoxină, pentru tulpinile aparţinând F.graminearum au fost propuse mai multe perechi de primeri, consideraţi specifici pentru sinteza de DON, respectiv de NIV. In experimentele efectuate am utilizat perechea de primeri Tri7f1/Tri7r1, propusă de Lee şi colab. (2001) care, prin dimensiunea produsului de amplificare produs, ar permite decelarea între tulpinile producătoare de DON sau de NIV. Astfel, la tulpinile de F.graminearum testate au fost evidenţiat produşi de amplificare unici, cu dimensiuni ce au variat între 161 pb şi aprox.246 pb.

25. Rezultatele obţinute pentru tulpinile de F.graminearum analizate sugerează faptul că tulpinile F5, F16, F21, F27, PP7 şi PP10 aparţin chemotipului NIV, la acestea fiind evidenţiat ampliconului de 161 pb. Restul tulpinilor au evidenţiat ampliconi unici, cu dimensiuni ce au variat între 172pb şi 246 pb care, conform datelor din literatură se datorează prezenţei la nivelul regiunii amplificate a unor repetiţii a unei secvenţe de 11 pb de baze. In cazul tulpinilor noastre, numărul maxim al repetiţiilor secvenţei de 11 pb a fost de 8, faţă de 16, aşa cum s-a detectat la alte tipuri de tulpini. Prezenţa acestor ampliconi este dovada că tulpinile respective au capacitatea de a produce DON (aparţin chemotipului DON)

26. Pornind de la cercetările lui Wang şi colab. (2008) care au propus utilizarea unor primeri specifici genei Tri13 ce codifică enzima 3-acetiltricotecen C-4 hidroxilaza, în experimentele următoare au fost folosiţi primerii notaţi Tri13P1/Tri13P2. Tulpinile aparţinând chemotipului NIV conţin genele Tri7 şi Tri13 funcţionale, în timp ce la tulpinile incluse în chemotipul DON cele două gene sunt nefuncţionale. • In cadrul experimentelor efectuate cu cele 40 de izolate de Fusarium au fost obţinuţi produşi de amplificare cu dimensiuni apropiate celor din literatură, corepunzători chemotipurilor 3-ADON, respectiv15-ADON. Pe baza rezultatelor obţinute se poate afirma că izolatele notate FI31, FI42 şi FI61 aparţin chemotipului 3-ADON, în timp ce izolatele notate FI48, FI50, FI51, FI53, FI58, FI59, FI60, FI62, FI63, FI64, FI70, 92 şi 8713 aparţin chemotipului 15-ADON.

27. Evidenţierea ampliconilor asociaţi cu producerea de 3-ADON (aprox.600 pb), respectiv 15-ADON (aprox.500 pb)

28. CONCLUZII • Reacţia PCR multiplex cu primeri specie-specifici a condus la identificarea a 64 de tulpini de F.graminearum şi a trei tulpini de F.culmorum • Pentru evidenţierea capacităţii tulpinilor de Fusariun de a produce tricotecene a fost utilizată perechea de primeri tox5-1/tox5-2, produsul de amplificare cu dimensiunea de aprox.650 pb (descris în literatură) fiind regăsit la toate izolatele; • Testarea în reacţie multiplex PCR a primerilor N1-2/N1-2R şi 4056/3551 a condus la constatarea că, majoritatea tulpinilor testate ar putea produce cantităţi crescute de tricotecene, fiind însă necesară confirmarea prin testarea cantitativă a micotoxinelor; • Experimentele privind încadrarea izolatelor de F.graminearum în chemotipurile DON sau NIV au condus la identificarea a 4 tulpini care ar aparţine chemotipului NIV (F5, F16, F21, F27), restul aparţinâd chemotipului DON • Folorirea unor primeri specifici pentru genele Tri7 si Tri 13 s-a reusit determinarea chemotipului la noile izolate dar pentru confirmare sunt necesare si unele teste biochimice calitative.