EFŽ

EFŽ Ekofyziologie přezimování ektotermů ruměnice pospolná (Pyrrhocoris apterus) České Budějovice, Stromovka, leden 2003  Vladimír Košťál Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav 2009

EFŽ EFŽ Environmentální fyziologie živočichů Vladimír Košťál, 2009 Biologické centrum AV ČR Entomologický ústav http://www/entu.cas.cz/kostal/

EFŽ Teplota • teploty v biosféře se pohybují řádově v rozmezí od -80 do +80 °C • životní procesy jsou podmíněny přítomností vody v kapalné fázi (teoreticky 0 až 100C) • teplota přímo ovlivňuje celou řadu biofyzikálních a biochemických struktur a procesů: • - rozpustnost plynů ve vodě • - iontovou disociaci molekul a pH • - rychlost pohybu (energii) molekul • - prostorovou konformaci molekul • - tekutost a fázi biologických membrán • - aktivitu enzymů • -  rychlost metabolických drah, fyziologických procesů a životních projevů • změny teploty zasahují velké množství "cílových" struktur a procesů zároveň • struktury a procesy jsou "naladěny" na určitou optimální teplotu • změny teploty v jednotlivých (mikro)-habitatech jsou: • - běžné (ale ne všudypřítomné: abysál, litosféra, tropy) • - habitatově specifické • - často cyklické (denní, sezónní) • organismy jsou adaptovány na teplotní proměnlivost jejich habitatů • adaptované organismy jsou schopny absolvovat fenotypickou změnu  teplotní aklimaci (aklimatizaci)

EFŽ Poškozující účinky teplot mimo optimum • tvorba ledových krystalů • pevná fáze vody je neslučitelná s aktivními životními procesy, • dochází k zakoncentrování nezmrzlé části roztoku, dosažení až toxických koncentrací, • objemové změny mohou překročit mechanické a elastické limity buněk • změna optimální konformace proteinů až denaturace • zpomalení procesů • rozpad polymerů na podjednotky • nízkoteplotní denaturace pod ca. -15°C • vysokoteplotní denaturace nad ca. 45°C • změny vlastností lipidů v biologických membránách • narušení optimální "tekutosti" pro funkci integrovaných proteinů • neregulované fázové přechody do gelové nebo hexagonální fáze jsou neslučitelné s funkcí membrány • narušení elektrochemických potenciálů přes buněčné membrány a epiteliální tkáně • desynchronizacemetabolických funkcí • "uncoupling", "disorder" • nedostatek energie ve formě ATP • zpomalení až ustávání základních procesů: transkripce DNA, syntézy a degradace proteinů, • transportů, komunikace a přenosu signálů • nekrotická nebo apoptotická buněčná smrt

EFŽ Termální biologie bezobratlých • převažuje poikilotermie a ektotermie • relativní homeotermie je možná • buď ve stabilním prostředí (moře) • nebo díky behaviorální termoregulaci • basking = slunění • ukrývání – ochlazování • velmi účinná strategie: půda na slunci larvy půda ve stínu • behaviorální termoregulace nymfP. apterus • za letního dne • endotermie připadá v úvahu za letu, • který vyžaduje velmi rychlý oxidativní • metabolismus a naopak je potřeba • se efektivně zbavovat přebytečného • tepla

EFŽ Endotermie super-organismu • při pojetí hnízda (kolonie) hmyzu jako super-organismu, můžeme také uvažovat endotermii: • hnízdo marvenců • Pogonomyrmex badius • (Florida, USA) • v hloubce půdy je • relativně velmi stálá • teplota • přemísťováním plodu • lze zajistit termoregulaci •  optimální teplotu pro • vývoj • přezimující larvy muchnic březnových • (Bibio marci) tvoří kolonie (hnízda), • larvy konzumují detrit a produkují • exkrementy na nichž se živí bakterie • a společně tak produkují teplo ...

EFŽ Endotermie super-organismu • hnízda termitů mají termoregulační • systém chodeb vzdušných a kanálů ... • včelí úly snímané infračervenou kamerou ... který je vzorem futuristických staveb • záznam teplot v hnízdě • a okolí u dvou druhů včel • Apis mellifera (nahoře) • Trigona carbonaria (dole)

EFŽ Supra-optimální (vysoké) teploty • jak se vyrovnat se zvýšením • teploty prostředí ? • behaviorální termoregulace • evaporace (omezená u malých živočichů) • kviescence • diapauza • biosyntéza termoprotektantů • (dosud popsána pouze u molic a mšic) • expozice ve vysokých, subletálních teplotách • stimuluje akumulaci sorbitolu (myo-inositolu) • polyoly chrání proteiny před denaturací teplem • up-regulace šokových proteinů (HSPs) • - indukčním faktorem jsou chybně • složené proteiny nebo částečně • denaturované proteiny • vliv sorbitolu • (tmavé sloupce) • na relativní aktivitu dvou • enzymů molice • Bemisia argentifolii • za různých teplot

EFŽ Denní oscilace teplot • letní denní maxima • v některých mikro-habitatech • dosahují supra-optimálních teplot: • larvy vrtule jablečné (Rhagoletis pomonella) • žijí ve dřeni jablek ... ... a v době teplotního maxima syntetizují šokové proteiny max. • záznam teploty v průběhu dne • - nahoře: vzduch • - dole: dřeň jablka na slunci Lopez-Martinez & Denlinger (2008). Physiol. Entomol. 33, 346-352

EFŽ Sub-optimální (nízké) teploty • definice nízkých teplot Rychlost procesu (vývoj, růst, pohyb ...) minimum optimum maximum hypotermní stav kryotermní stav 20 – 30 °C ULCIZ podchlazený stav promrzlý stav Tělní teplota [°C] m.p. LTT SCP 0°C (Lower Temperature Threshold) SCP, supercooling point reálná teplota krystalizace tělní vody • Oblast nízkých teplot začíná pro různé druhy hmyzu • (a v různých situacích) na různých hodnotách teploty LTT: • tropické druhy: ca. 10 - 15°C • neaklimované temperátní druhy: ca. 5 - 15°C • aklimované temperátní a polární druhy: až -0.6°C (m.p.) m.p., melting point rovnovážná teplota tání a krystalizace tělní vody

EFŽ short day 50°N short night Příprava k přezimování začíná v létě AKTIVITA letní slunovrat: 21. června zimní slunovrat: 21. prosince DIAPAUZA HIBERNACE • krátký nebo zkracující se den • po letním slunovratu je signálem • příchodu zimy • začíná příprava na zimu • sezónní změna fenotypu zkracování délky dne

EFŽ Časoměrné systémy sledují délku dne ... Hmyz Savci laterální neurony suprachiasmatická jádra

EFŽ Časoměrné systémy sledují délku dne ... Biologické hodiny Hmyz Savci • biologické hodiny hmyzu a savců mají shodný princip a sdílejí i některé „hodinové geny“ • produkty hodinových genů (proteiny) však mohou nabývat různých funkcí u různých druhů

EFŽ ... transdukují fotoperiodický signál ... Hmyz Savci melatonin PDF ... a ovlivňují výdej důležitých hormonů podzim - zima gonádotropiny prolaktin juvenilní hormon ekdyson "hormony léta"

EFŽ Nedostatek „hormonů léta“ • způsobí změnu fenotypu Savci Hmyz • zastavují rozmnožování • zastavují rozmnožování • hromadí energetické zásoby • hromadí energetické zásoby tuková kapénka granule glykogenu svišť Marmota marmota ploštice Pyrrhocoris apterus buňka tukového tělesa • zlepšují izolační vrstvu • mění srst • zlepšují izolační vrstvu • mění sílu a kvalitu voskové vrstvy • mění chování • shání potravu • hledají/budují zimní doupata • migrují do teplejších oblastí • mění chování • shání potravu • hledají/budují zimní úkryty • (migrují do zimovišť)

EFŽ Fenotypická změna je komplexní ... • je pozorovatelná jako hluboká sezónní změna transkriptómu a proteómu Savci Hmyz kukly masařky Sarcophage crassipalpis proteiny up-regulované při vstupu do diapauzy sysel Spermophilus lateralis proteiny up-regulované při vstupu do hibernace

EFŽ Fenotypická změna je komplexní ... short days decreasing temperature perception reproducing cold-sensitive animal in summer transduction diapausing cold-hardy animal in winter hormonal milieu gene expression developmental mode cryoprotectants behaviour ice nucleators morphology antifreeze proteins protein activities antioxidants shock proteins metabolism defence systems energy reserves membranes water balance ion homeostasis

EFŽ V čem je tedy rozdíl ? Savci Hmyz • jsou endotermní • regulují svou tělesnou • teplotu po celou zimu • je ektotermní • nedokáže účinně regulovat • svou tělesnou teplotu během zimy typický záznam zimních teplot vzduchu a v listové hrabance pod lipami (České Budějovice) průběh tělních teplot u hibernujícího sviště tělní teplota sleduje teplotu prostředí a ta často,někdy hluboko a dlouhodobě, klesá pod nulu nastavují "regulátor teploty" v hypotalamických neuronech na nižší, ale nad-nulovou hodnotu

EFŽ Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot 1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné(ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) ! • toto jsou dvě • nejčastěji uváděné • a porovnávané • strategie 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty

EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - subnivál • strategie živočichů obývajících • teplotně pufrované habitaty (půda) • kolonie chvostokoků Ceratophysella sigillata • migrující po sněhu v lednu • (Švýcarsko, 600 m n.m.) • během migrace se páří, živí se na nárůstech • řas na odumřelém dřevě (v létě upadají do • dormantního stavu)

EFŽ Sezónní aktivita za nízkých teplot - mediterán • někteří členovci přesunuli aktivní fázi svého • životního cyklu (růst, vývoj, reprodukci) • do chladného období roku • adaptivní výhodou přesunu aktivní fáze je • patrně využití volné niky s nižším tlakem • parazitů a predátorů a s dostatkem potravy • brouk z čeledi Catopidae • (západní a střední Evropa), • jehož larvální vývoj probíhá • v zimě, imaga prodělávají • aestivaci a kladou na podzim • živí se saprofágně a nekro- • fágně • letní podmínky mohou být nepříznivé • zatímco zimní jsou relativně permisívní • typicky v mediteránních habitatech • - desikace • - nedostatek potravy • - biotický tlak) •  zimní aktivita • letní dormance, aestivace Chionea sp. Triphleba sp. (Diptera) Boreus sp. (Mecoptera) • imaga srpice Boreus a více druhů much se páří • na sněhu v zimě • často jsou imaga bezkřídlá

EFŽ Extrémní – polární habitaty • navzdory drsnosti klimatických • podmínek a omezenosti zdrojů • je druhová diverzita členovců • (hmyzu !) za severním • polárním kruhem poměrně velká • Arktida má mnohem větší • druhové bohatství díky spojení • s pevninou • příklad: za hranicí růstu stromů • žije jen v Severní Americe na • 2200 druhů hmyzu ! • polární kruh = 66° j. nebo s.š. • vymezení hranice tundry (a alpinní zóny) = izoterma 10°C nejteplejšího měsíce roku • relativní porovnání aspektů polárního klimatu:ArktidaAntarktida • drsnostnízké teploty a teplotní extrémyvelká ještě větší • sezónnostrozdíl mezi létem a zimou zřejmá méně zřejmá • predikovatelnostdlouhodobá, sezónní dobrá slabší • krátkodobá, během léta slabá mizivá • zdroje potravydostupnost, bohatost omezené velmi omezené

EFŽ Extrémní – polární habitaty • vymezeny zhruba polárními kruhy (66 s.š. nebo j.š.) • přesněji izotermou 10C nejteplejšího měsíce (přibližně hranice růstu stromů) ostrov Jamese Rosse Česká antarktická základna

EFŽ Stálá aktivita za nízkých teplot – sub-polární habitaty • v sub-Antarktických suchozemských • habitatech je stálá nízká teplota • - teploty kolem 0C • - větrno • - vysoká vlhkost (časté srážky) travnatý Marion Island • housenka můry Pringleophaga marioni • je klíčovým dekompozitorem • (největším herbivorem) • sub-antarktického ostrova • Marion island (JAR) • housenky se vyvíjejí několik let • imaga jsou brachypterní • housenky tolerují mírné promrznutí • SCP je kolem -5°C • spodní limit přežívání je necelých -6 °C [C] [uL CO2 / h / mg] • obrázek ukazuje: • b = prudký pokles metabolismu při teplotě -0.6 °C, • který není způsoben mrznutím ale odpovídá • vstupu do "chill coma" stavu • Tc = peak CO2, který přesně koresponduje • s teplotou krystalizace (zvětšení objemu • vody při mrznutí  stlačení  vypuzení CO2) • střední část = nenulový metabolismus • v promrzlém stavu • konec = okamžité obnovení metabolismu • po vzestupu teploty

EFŽ Adaptace na život za polárními kruhy • Výběr mikrohabitu • pufrované habitaty pro aktivitu a "letní" ukrývání: • půda, travní trsy, ptačí guáno • osluněná místa pro "basking„ • zimní úkryty • – pufrované (pod sněhem) • – exponované – překvapivě často je volen • exponovaný zimní úkryt • s nízkou vrstvou sněhu •  zdá se, že krátkost letního období • je v mnoha případech větší evoluční • překažkou než extrémnost zimních teplot • Morfologická přizpůsobení • malá velikost • melanismus • hirsutismus • apterygie • bezkřídlá moucha Anatalanta aptera • žije v ptačím guánu na sub-Antarktických • ostrovech

EFŽ Antarktický bestiář • bezkřídlá moucha Belgica antarctica • žije v guánu kolonií tučňáků • larvy se vyvíjí dva roky, imago • žije jen několik dnů • délka 2-6 mm •  největší suchozemský živočich • pevninské Antarktidy • Rick Lee & Dave Denlinger • roztoč Alaskozetes antarcticus • se vyvíjí pod kameny 5 – 7 let • chvostoskok Cryptopygus antarcticus • žije 3 roky • parazitické klíště Ixodes uriae saje • krev ptáků na obou pólech • může hladovět až 11 měsíců, pak • tvoří shluky pod kameny v ptačích • koloniích

EFŽ Polární adaptace životního cyklu • fotoperiodický signál je v polárních zónách • silně ovlivněn polárním létem/zimou, • členovci žijí v pufrovaných • mikrohabitatech (půda, vegetační kryt, subnivál) •  sezónní průběh teploty bývá hlavním ignálem • pro načasování životního cyklu • partenogeneze • eliminace nutnosti páření a celého sexuálního • chování (vyhledávání partnera) • stabilita genomu, který se "osvědčil" v danných • podmínkách • redukce adultního stádia • většinu životního cyklu zabírají nedospělá stádia • a stádium imaga bývá velmi efemérní až redukované • arktické muchničky (Simulidae) • dospělé samičky mají redukované ústní ústrojí • vajíčka se vyvíjejí již u farátních imag z larválních • zásob • častá pathenogeneze • Prosimulium ursinum= extrémní případ: • dospělá samička se vůbec nelíhne z kukelní • schránky, nýbrž umírá a po rozpadu schránky • se vajíčka uvolňují do potoků, kde se z nich • líhnou partenogenetické larvy příští jaro ... • polární léto je krátké a chladné • a pouze omezená suma energie je dostupná pro dokončení celého vývojového cyklu •  strategie max. urychlení vývoje •  strategie rozdělení vývoje do ročních fází • oddělených přezimováním • Strategie urychleného vývoje • akcelerace letního vývoje • skupiny charakteristické krátkým vývojem • (malé mouchy, mšice) jsou početně zastoupeny • u mšic jsou většinou eliminovány letní parteno- • genetické generace vivipar a fundatrix rovnou • produkují sexuální morfy, které kladou přezimu- • jící vajíčka • mono-voltinnost zajišťuje, že přezimování je • vystaveno vždy stejné, rezistentní vývojové • stádium (vajíčko, kukla) • imago muchničky • Prosimulium sp.

EFŽ Polární adaptace životního cyklu Strategie víceletých životních cyklů • velmi častá strategie různých taxonů • (roztoči, pavouci, chvostoskoci, hmyz) • 2 – 7 leté cykly jsou obvyklé, přezimování je • možné ve více (nebo všech) stádiích • můra Gynaephora groenlandica • arktická můra Gynaephora groenlandica (Grónsko) má až 14 letý cyklus • housenky se živí listy • arktické zakrslé vrby • Salix arctica • v létě tráví 60 % • času "baskingem" • (v noci) a zbytek • žírem (v poledne) • tolerují zmrznutí • i v létě • v létě jsou 2/3 populace • parazitovány • (Hyposoter, Exorista) • přezimování housenek: • již po slunovratu nastupuje diapauza, • migrace do půdy  hypotermie • důvody: aktivita parazitů • pokles kvality potravy • příprava na zimu • příprava na zimu: • akumulace glycerolu a trehalózy • degradace mitochondrií (2 měs.) • jarní rekonstituce mitochondrií trvá • asi 2 týdny

EFŽ Strategie hmyzu pro přežití nízkých teplot 1. Regulovat tělní teplotu na úrovni jedince fyzikálně nemožné(ne-efektivní) na sezónní škále teplot do jisté míry možné na úrovni „super-organismu“ 2. Migrovat velikost těla umožňuje migrace pouze na malé vzdálenosti (vyjímky existují - Danaus) 3. Zůstat aktivní v tepelně pufrovaném prostředí synantropní druhy (opportunistic survival) půda, subniveální biotopy (winter activity) 4. Vstoupit do dormance a tolerovat zchlazení až podchlazení (vyhnout se zmrznutí) (chilling tolerance) (freezing-susceptibility or -avoidance) ! • toto jsou dvě • nejčastěji uváděné • a porovnávané • strategie 5. Vstoupit do dormance a tolerovat či regulovat zmrznutí (freezing-tolerance) 6. Vstoupit do dormance a potom (částečně) dehydrovat (protective dehydration) možnost následné vitrifikace, týká se edafonu 7. Rychlá chladová aklimace (rapid cold hardening) ochrana před denní fluktuací teploty

EFŽ Co se stane s vodou za pod-nulových teplot ? • homogení nukleace • fázové chování vody ve vodných • roztocích tělních tekutin: • - hemolymfa • - obsah střeva (a jiných lumenů) • - intracelulární roztoky • každá molekula vody v ledu • tvoří vodíkové můstky se • čtyřmi sousedními • molekulami (tetrahedrální • vazba) • a zakládá tak velmi • charakteristickou hexagonální • strukturu ledových krystalů • heterogení nukleace • krystalizce je „katalyzována“ • přítomností nukleátorů Bod tání (rovnovážný bod mrznutí) nukleátor snížení teploty solut extra-cell. intra-cell. Teplota krystalizace (reálný bod mrznutí) • vytvoření ledových krystalků v tělních tekutinách • vede k osmotickému odsávání vody z buněk • a tím k jejich dehydrataci a smršťování

EFŽ Intracelulární zmrznutí = smrt ? • alespoň jeden druh háďátka, Panagrolaimus davidii, přežívá intracelulární zmrznutí • obyvatel Antarktických půd • mikorklimatické teploty se • pohybují • od +22*C (letní den) • do -45*C (zimní noc) • saturace mikroklimatu vodou • se pohybuje od 0 do 100% • háďátko přežije buď promrzlé • (inokulace přes řitní otvor) • nebo zcela dehydratované • rovněž u izolovaných buněk tukového tělesa larvy vrtule Eurosta solidaginis bylo pozorováno • přežití intracelulárního promrznutí ...

EFŽ Tvorba ledu – mrznutí • Heterogenní nukleace • Led v prostředí jako nukleátor • ačkoli led nesnadno proniká přes kutikulu • či přes lipidickou membránu (hydrofobní • struktury), při kontaktu těla s ledem může • dojít k nukleaci a promrznutí tělních tekutin • skrze tělní otvory osa a • Bakteriální nukleátory • lipoproteiny 120 – 180 kDa na povrchu • membrány epifytních bakterií • Pseudomonas syringae • Erwinia herbicola • Enterobacter aglomerans • rozmístěny v agregacích, jež jsou nutné • pro jejich nukleační aktivitu, • adaptivní význam pro bakterie – poškození • epitelu mrazem, zpřístupnění potravy • dostávají se do střeva hmyzu a mohou • iniciovat mrznutí obsahu střeva již při • teplotách ~ -2°C osa c • voda většinou nezačíná mrznout po dosažení rovnovážného bodu mrznutí, • který odpovídá bodu tání (melting point, m.p.) • hodnota bodu tání je koligativně (přímo úměrně) ovlivněná sumární • koncentrací solutů = osmolalitou roztoku: 1 osmol/kg = m.p. -1.86°K (°C) • při teplotách pod m.p. voda zůstává v kapalné (podchlazené) fázi dokud • nedojde k heterogenní či homogenní nukleaci ledu • homogenní nukleace: spontánnízfomování nadkriticky velkého zárodečného • krystalu ledu (při -5°C ~ 45 000 molekul vody, při -40°C ~ 70 molekul) • heterogenní nukleace: zformováni krystalu na vhodném povrchu (katalýza) • po zformování zárodečného krystalu nastává jeho explozívní růst a mrznutí • okolní vody  SCP, rychlé promrzání za současného uvolnění tepla • bod podchlazení (supercooling point, SCP) = reálná teplota krystalizace vody • stochastická veličina závislá na objemu vody, nukleátorech a čase • Tělu vlastní nukleátory • většinou nebyly přesně charakterizovány • patrně určité epitopy membránových • proteinů a/nebo lipoproteiny

EFŽ Anomální chování vody při poklesu teploty molekuly vody v kapalné vodě • kapalná voda má maximální hustotu • při teplotě +4ºC • ohříváním nad tuto teplotu se hustota vody • snižuje (obvyklý jev) • zchlazovaním pod tuto teplotu se hustota vody • také snižuje (anomální jev) • reálná teplota krystalizace vody (tvorby ledu) • například v rybníce se příliš neliší od 0ºC, • protože rybník je velký, obsahuje mnoho hetero- • genních nukleátorů a proto je pravděpodobnost • vzniku ledu vysoká (voda tedy nedosahuje podchla- • zeného stavu) • voda o teplotě 4ºC klesá ke dnu neboť je hustší než voda • o teplotě 0ºC. U dna rybníka je vyšší teplota než u hladiny (ledu) • destilovanou vodu v menší nádobě můžeme podchladit • až na přibližně -15ºC, aniž by vznikal led • velmi malé objemy vody (nL a méně) lze podchladit • až na teplotu přibližně -40ºC • vodu v kapilárních pórech o nanometrových rozměrech • se podařilo podchladit až na -110ºC • (PNAS 104, 9570, 2007) • podchlazená voda se rozpíná až do teploty -63ºC a teprve • poté začíná houstnout molekuly vody v hexagonální krystalické mřížce ledu teplota vody u dna zamrzlého rybníka je vyšší než u hladiny (ledu) (Slavíček: Vesmír 87, 222-223, 2008)

EFŽ Podchlazení vs. promrznutí Voda: • voda zůstává v kapalném stavu • voda v extracelulárních prostorech se mění na led • dochází k silné dehydrataci buněk • hrozí ztráty vody • voda je "konzervována" v ledových krystalech Metabolismus: • led brání difůzi kyslíku, • anaerobnímetabolismus buněk je minimální • až nulový = kryobióza • aerobnímetabolismus se zpomaluje, • nikoli však zastavuje • jsou např. udržovány transmembránové • elektrochemické potenciály • transmembránové elektrochemické potenciály • zcela disipují • metabolismus je relativně aktivní : • - vyžaduje přísun energie • - vyžaduje koordinaci • - je náchylný k poškození • metabolismus je v hluboké supresi: • - umožňuje šetřit energií • - nevyžaduje koordinaci • - je odolný vůči poškození

EFŽ Bod podchlazení – supercooling point (SCP) 0°C strategie -20°C podchlazení -60°C částečně chráněné nechráněné mikro-habitaty chráněné mikro-habitaty 0°C strategie zmrznutí -20°C -60°C (Turnock and Fields, E.J.E. 102, 561-576, 2005) • meta-analýza bodů podchlazení u ca. 350 druhů hmyzu • osa x: 11 habitatů seřazených podle "náročnosti" chladné sezóny (1 = tropy, 11 = kontinentální polární oblasti) • osa y: teplota bodu podchlazení (0 až -60°C) • korelace mezi teplotní náročností habitatu a hodnotou SCP byla nalezena pouze v případech: • strategie podchlazení u druhů zimujících v částečně chráněných nebo nechráněných mikrohabitatech • modré čáry vymezují SCP = -20°C • na tuto hodnotu může poklesnout SCP u malých druhů hmyzu pouze díky odstranění heterogenních nukleátorů

EFŽ Podchlazení – problém s desikací • množství a složení kutikulárních lipidů • bývá odlišné u nediapauzních a diapauzních stádií • snižuje se podíl osmoticky aktivní, • tzv. "volné" vody • akumulací hydrofilních polymerů • - glykogen (sval, tukové těleso) • - hexamerní proteiny (hemolymfa) • - LEA proteiny • akumulací osmolytů • - volné aminokyseliny (prolin) • - cukry (trehalóza, glukóza, ...) • - polyoly (glycerol, sorbitol, ...) kukly Pieris rapae crucivora (bělásek řepový) bílé sloupce: nediapauzní černé sloupce: diapauzní • metabolická suprese • vede k zpomalení frekvence dýchání • a tedy i k nižším respiračním ztrátám vody Kaneko and Katagiri, 2004 Naturwissenschaften 91,320-323 • diapauzní kukly P. rapae mají několikrát silnější vrstvu • uhlovodíků na povrchu kutikuly: • nediapauzní kukly: tloušťka 11 nm • diapauzní kukly: tloušťka 195 nm • mění se i kvantitativní zastoupení jednotlivých uhlovodíků: • diapauzní kukly: 29:0  • 29:1  • 31:1 

EFŽ Podchlazení – problém s potenciály podchlazení • hmyz, přezimující • v podchlazeném stavu • musí udržovat • iontovou homeostázu Kostal et al., 2004 J. Exp. Biol. 207, 1509-1521 • vlevo: přežívání imag P. apterus za teploty -5C • vpravo: rovnovážné potenciály na membránách • tukového tělesa P. apterus za teploty -5C nd. wa non-diapause, warm-accl. d. wa diapause, warm-acclimated d. ca. diapause, cold-acclimated Pyrrhocoris apterus zmrznutí • hmyz, přezimující v promrzlém stavu • rychle ztrácí elektrochemické • potenciály, ale je schopen opět • je rychle generovat po "roztání" Na+ Mg++ Kristiansen and Zachariassen, 2001 J. Insect Physiol. 47, 585-592 K+ Xylophagus cincta

EFŽ Podchlazení – problém se stabilitou stavu • většina hmyzu přezimuje v podchlazeném • stavu a promrzá až při -15 až -50°C Akumulace Anti-Freeze proteinů (AFPs) • Odstranění nukleátorů • střevní (bakteriální ?) nukleátory • jsou odstraňovány evakuací střeva, • typickou pro nástup diapauzy • mechanismy sekvestrace dalších • (vnitrobuněčných) nukleátorů jsou • prakticky neznámé (ostatně jako nukleátory samy) • pouhým odstraněním nukleátorů se SCP sníží • u mnoha druhů hmyzu na ~ -15 až -25°C • (protože vodní kompartmenty jsou malé) • podchlazený stav je však meta-stabilní a kdykoli • může dojít k homogenní nukleaci (AFP) • Stabilizace podchlazeného stavu je nutná • snížením mobility vodních molekul, díky • zvýšení viskozity po částečné dehydrataci, • popřípadě akumulaci osmolytů, • relativním zvýšením frakce tzv. "vázané vody" • v hydratačních obalech solutů a na hydrofilních • površích (membrány, makromolekuly) • regulace exprese AFP u Tenebrio molitor teplotou a fotoperiodou • sezónní druhy up-regulují AFPs i po vystavení krátkému dni • dalšími stimulátory jsou desikace a hladovění

EFŽ Anti-Freeze Proteins – AFPs • schema aktivity AFPs a termální hystereze • AFPs hmyzu • charakteristické repetitivní sekvence • nalezeny u ca. 50 druhů hmyzu a také u roztočů, • pavouků a stonožek • poprvé byly AFPs charakterizovány u polárních ryb (DeVries, • 1971) a později také u hmyzu (Duman, 1977) a rostlin • schopnost adsorbovat se na povrch zárodečného • krystalu a potlačit jeho růst při poklesu teploty pod m.p. • v rozsahu ca. 2 až 8°K = termální hystereze • brání růstu zárodečného krystalu podle osy c (tvoří se placky) podchlazení • stabilizují meta-stabilní podchlazený stav zmrznutí • brání rekrystalizaci • (spojování menších krystalů do větších)

EFŽ Struktura AFPs • porovnání krystalové struktury tří různých typů hmyzích AFPs: • společné vlastnosti • všech tří typů: • - repetitivní sekvence • - opakující se motivy aminokyselin, • ß-listů nebo α-šroubovic • - zpevnění disulfidickými můstky • a vodíkovými vazbami • - „plochý“ povrch na jedné straně: • adsorpce na ledový krystal • vlevo: Tenebrio molitor (Coleoptera) – opakování motivu 12 aa, typický triplet Thr-Cys-Thr • uprostřed: Choristoneura fumiferana (Lepidoptera) – motiv 15 aa s tripletem Thr-X-Thr • vpravo: Hypogastrura harvei (Colembolla) – motiv Gly-Gly-X Doucet et al. (2009) Cell. Mol. Life Sci.

EFŽ Ice Nucelating Agents - INAs • také: Protein Ice Nucleators (PINs) - nukleátory • objeveny u epifytických bakterií (Maki et al., 1974), • a později nalezeny rovněž u hmyzu (Duman, 1978) • funkční podstata spočívá patrně ve vytváření "matrice", • neboli katalytického povrchu, který je vhodný pro • uspořádávání molekul vody do krystalové mřížky ledu • kooperativní agregace • INAs zvyšuje nukleační • aktivitu LÉTOZIMA zmrznutí podchlazení intra-celulární a intra-luminární nukleátory • scanning tunneling mikrofoto sezónně syntetizované nukleátory v hemolymfě Yeung et al., 1991 J. Vac. Sci. Technol. B9, 1197-1201 Zachariassen, 1980 J. Comp. Physiol. 140, 227-234 • charakterizovány u larev tiplice Tipula trivittata • globulární lipoproteiny o sumární • velikosti ~ 800 kDa, průměru ~ 135 Ǻ • proteinový dimer plus fosfatidylinositol • obsahují repetitivní sekvence 16 aminokyselin • druhy hmyzu, které spoléhají na strategii promrznutí, • je aktivně syntetizují a ukládají v hemolymfě • před příchodem chladného období • při poklesu teploty nehluboko pod 0°C promrzají

EFŽ Podchlazení – koligativní kryoprotektanty • koligativní deprese m.p. a SCP • při vysokých koncentracích (> 1 M) • m.p.: –1.86C / 1 mol • SCP: –2 až –6C / 1 mol Ips acuminatus • u glycerolu byly • zaznamenány • koncentrace až 5 M • (460 g / L) •  ca. 20 % sušiny • je přeměmněno na • glycerol (!!!) Gehrken, 1985 J. Insect Physiol. 31, 909-916

EFŽ Podchlazení – ne-koligativní kryoprotektanty • nekoligativní účinky • při nízkých koncentracích (< 1 M) • deprese m.p. a SCP je zanedbatelná • zimní akumulace • sorbitolu a ribitolu • v sumární koncentraci • < 100 mM • u přezimujících • ploštic P. apterus • u mnoha druhů hmyzu byla pozorována • sezónní (zimní) akumulace polyolů • v koncentracích < 1 M • akumulace většinou dobře koreluje s maximem • chladové odolnosti • jaký je mechanismus účinku nízkých koncentrací ? • (když ne koligativní) Kostal and Simek, 2000 J. Insect Physiol. 46, 1321-1329

EFŽ Sezónní akumulace kryoprotektantů • předběžnou podmínkou pro akumulaci je změna metabolismu spojená se vstupem do diapauzy • vlastním spouštěčem akumulace je potom vystavení nízké teplotě – chladová aklimace • velmi typicky je spouštěcí teplotou 5C Kostal and Slachta, 2001 Acta Soc. Zool. Boh. 65, 239-245 • Spouštěč • akumulace polyolů je spouštěna poklesem • teploty pod 5C • Korelace • sumární koncentrace polyolů dobře • koreluje s chladovou odolností

EFŽ Průkaz nekoligativního účinku • injikace polyolů do těla diapauzní ploštice diapauseadult (pre-acclimated) • změny po injikaci (po 1 dnu): koncentrace polyolů: se zvýšila z 2.5 na 83.1 mOsmol.L-1 (byla dosažena typická zimní hodnota) bod podchlazení (SCP): se nezměnil (zůstal na -18.0°C) (koligativní účinky byly zanedbatelné) přežívání za -14°C/ 3d (chladová odolnost) se zvýšilo z 13.3 % na 41.5 % 250 ug 500 ug ------------------- 2 uL inj. buffer • nekoligativní účinek nízkých koncentrací • polyolů byl takto přímo prokázán • jakým mechanismem nízké koncentrace • polyolů zvyšují chladovou odolnost ? Kostal et al., 2001 Comp. Biochem. Physiol. B130, 365-374

EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění • základem je pozorování Hofmeistera z konce 19. století: • některé ionty stabilizují proteiny (napomáhají jejich rozpuštění ve vodě) • jiné de-stabilizují proteiny (napomáhají jejich vysrážení) •  Hofmeistrovy řady solutů: • později bylo zjištěno, že přírodní kompatibilní osmolytya kryoprotektanty často obsahují • právě stabilizující funkční skupiny (např. amino-skupiny) • mechanismus různého účinku různých solutů • zůstával dlouho neobjasněn • teprve koncem 20. století bylo navržena hypotéza • preferenčního vytěsnění kompatibilních solutů • preferenční vytěsnění kryoprotektantů (disacharidy • oranžově a prolin černě) z domény proteinu vede k • preferenční hydrataci proteinu (N) a stabilizaci jeho • funkční konformace hydratačním obalem

EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění • A a C) • de-stabilizující • soluty • B a D) • stabilizující • soluty • A a B) • rozmístění • molekul solutu • C a D) • vliv na strukturu • proteinu • empirická pozorování • Timasheffa pomocí dialyzační • membrány prokázala, že • stabilizující soluty jsou • vytěsňovány z okolí proteinu • a tím je protein přednostně • hydratován de-stabilizing solutes  protein denaturation and aggregation stabilizing solutes  protein preferential hydration  stabilization

EFŽ Mechanismus preferenčního vytěsnění • ukázalo se však, že "chemické" mechanismy, • jež jsou příčinou vytěsnění, nevysvětlují • stabilizační efekt • klíč k pochopení principu stabilizace je • v termodynamice chování proteinu • ve vodných roztocích • přídavek osmolytu k nativnímu proteinu ve • vodném roztoku vede paradoxně ke zvýšení • jeho volné energie • podstatné je, že denaturace proteinu chráně- • ného osmolytem vyžaduje větší změnu volné • energie než denaturace proteinu bez osmolytu • Naq Uaq (ΔG1)< NosUos (ΔG3) N .... nativní protein U .... unfolded (denaturovaný) protein aq .. aquaeous (vodný) roztok os .. osmolyt ve vodném roztoku ΔG . změna volné energie systému • právě rozdíl ve změně volné energie je příčinou • "nesnadnější" denaturace proteinu v systému • s kryoprotektantem a tím také zvýšené • stability proteinu

EFŽ Biosyntéza kryoprotektantů • nejčastěji se jedná o cukerné polyoly • tedy deriváty glykolýzy: • - etylén glykol (2C) • - glycerol (3C) • - threitol (4C) • - ribitol (5C) • - sorbitol (6C) • - myo-inositol (6C) • často také o cukry samotné: • - fruktóza (6C) • - glukóza (6C) • - trehalóza (12C) • pravděpodobně i volné aminokyseliny: • - prolin glykogenová granule • tukové těleso • Pyrrhocoris apterus • (diapauzní imago) • inter-konverze glykogenu a myo-inositolu • u sluníček Epilachna sp. během přezimování • spouštěčem akumulace cukrů a polyolů je • nízká teplota (práh většinou ~ 5°C) • cukry a polyoly jsou produkty • degradace glykogenu • většina druhů hmyzu buduje zásoby glykogenu • v tukovém tělese v časných fázích diapauzy • tyto zásoby mohou být zcela konvertovány • na polyoly během přezimování • nízká teplota stimuluje (neznámým způsobem) prudký růst • koncentrace cAMP v cytosolu, • cAMP aktivuje protein kinázu A (PKA) a ta aktivuje kinázu • fosforylázy, kináza aktivuje inaktivní formu b glykogen fosforylázy • (GPáza) na aktivní formu a, • aktivní forma a GPázy štěpí glykogen a tak produkuje uhlíkové • skelety (glukózo-1P), které jsou dále přeměněny na polyoly ...

EFŽ Biosyntéza kryoprotektantů • glykolytický metabolismus prochází přestavbou • při vstupu do diapauzy tak, aby mohl produkovat polyoly • po vystavení chladu diapauzní jedinci za nízkých teplot: • snížení toku uhlíku k TCA Glycogen diapause metabolism • inhibice aktivity fosfofruktokinázy GPase (a+b) NADPH NADP+ • aktivizace glykogen fosforylázy • za teplot pod 5°C Glucose-1-P AR NADPH G6P-DH 6-P-Glucono- lactone Glucose-6-P Glucose • vyšší aktivita • glukózo-6P-dehydrogenázy Fructose-6-P Fructose S O R B I T O L Ribulose Ribose • aktivizace pentózového cyklu PFK-1 KR NADPH • vyšší produkce NADPH AR NADPH Fructose-1,6-bis-P PoDH NAD+ PoDH NAD+ R I B I T O L • vyšší aktivita aldózo reduktázy • specifická aktivita ketózo reduktázy CO2 NAD+ • snížená aktivita polyol • dehydrogenáz • (kvůli nedostatku NAD+) TCA cycle ATP NADH • biosyntéza a akumulace • ribitolu a sorbitolu Kostal et al., 2004 J. Insect Physiol. 50, 303-313 active metabolism

EFŽ

EFŽ

Presentation Transcript