Production d anticorps polyclonaux

1. Production d�anticorpspolyclonaux Vaccination

2. Principe Un antig�ne Un animal Une immunisation Un immun s�rum Des anticorps polyclonaux

3. Antig�nicit� Antig�ne L'antig�ne est d�fini comme une substance qui r�agit sp�cifiquement avec des anticorps ou des r�cepteurs cellulaires et qui est capable de stimuler une production d'anticorps ou une r�action cellulaire sp�cifique.

4. Immunog�nicit� Hapt�nes Ce sont aussi des mol�cules qui sont capable de r�agir sp�cifiquement avec l'anticorps, mais qui ne peuvent pas � elles seules provoquer la production d'anticorps par les cellules sp�cifiques. L'hapt�ne peut devenir immunog�ne lorsque que ce dernier est coupl� � un porteur ou carrier

5. Hapt�nes Compos�s non immunog�nes m�dicaments, compos�s organiques, peptides, oligosaccharides MW compris entre 2 et 5 kDa Conjugaison avec un porteur Antig�ne multivalent immunog�ne Anticorps anti-hapt�ne Porteur non pr�sent chez l��h�te Deux porteurs diff�rents en fonction des applications

6. Les porteurs S�rum Albumine Bovine (SAB) 50% des prot�ines du s�rum Porteur le plus utilis� pour immunisation chez la ch�vre et le mouton. MW 66 kDa

7. Les porteurs Keyhole limpet hemocyanin (KLH) Prot�ine de la respiration chez les mollusques. Tr�s immunog�ne, nombreuses lysines, (-NH2) Limitation des r�actions crois�es Polym�re MW 8-9 x 106 Da

8. Les porteurs Thyroglobuline T�tram�re Glycoprot�ine, pr�curseur des hormones thyro�diennes Extrait de la glande thyro�de Tr�s immunog�ne Absent du s�rum, limitation des r�actions crois�es Conjugaison avec les amines MW 670 kDa

9. Les agents couplant Sulfo SMCC H�t�ro bifonctionnel R�agit avec NH2 sur la prot�ine et SH sur l��hapt�ne Elimin� apr�s la conjugaison

10. Les agents couplant Mal�iimides

11. Anticorps Est d�fini comme anticorps toute substance dont la production est provoqu�e par l'administration d'antig�nes ou d'hapt�nes coupl�s � un porteur. Il s�agit toujours d�une immunoglobuline

12. Immunoglobuline

14. Production d�anticorps Immunisation Animal Dose Adjuvant M�thode Purification Pr�cipitation Chromatographie Autres

15. Animaux Lapin, souris, rat, cochon d�inde, hamsters Lapin le plus utilis� pour la production d�anticorps polyclonaux Facile � porter Propre Peuvent �tre pr�lev�s fr�quemment Bon producteurs, volume de s�rum important Souris, rat, cochon d�inde, hamsters Production d�anticorps monoclonaux G�n�tiquement �loign� de l�origine de l�immunog�ne

19. Dose Faibles de l�ordre du mg. L�antig�ne est purifi� L�antig�ne est en solution dans du tampon avec un adjuvant Site d�inoculation d�pend Du volume � injecter La vitesse de lib�ration La solution de solubilisation

21. Adjuvant Substances qui intensifient la r�ponse immunitaire de plusieurs mani�res : Protection de l�antig�ne d�un catabolisme pr�coce �mulsion eau dans l�huile ou huile dans l�eau Concentration de l�antig�ne, lib�ration lente de l�antig�ne Particules de silice, sels d�aluminium, latex etc� Stimulation de la production d�interleukine, inflammation Parois de bact�ries, peptidoglycanes de synth�se

24. Quelques adjuvants Montanide ISA Adjuvants [Seppic, Paris, France] Surfactants dans de l�huile non m�tabolisable Ribi's Adjuvants (Ribi ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT) D�tergents, squal�ne, bact�ies modifi�es. Hunter's TiterMax (CytRx Corp., Norcross, GA) Surfactants dans de l�huile non m�tabolisable Gerbu Adjuvant [Gerbu Biotechnik GmbH, Gaiberg, Germany/C-C Biotech, Poway, CA Aqueux, immunostimulateurs

25. Inoculation Sous cutan�e Lapin Plusieurs sites possible 800 �l Intramusculaire Lib�ration lente de l�ag Pas adapt� pour les petits animaux Intradermique Lib�ration tr�s lente de l�ag Petits volumes, l�antig�ne doit �tre concentr� Utilis� pour les gros animaux

26. Inoculation Intraveineuse Exposition rapide de l�antig�ne aux cellules immunocomp�tentes Dangeureuse, effets secondaires, choc anaphylactique Intrap�riton�ale Souris et petits animaux 500 �l Directement dans les organes lympho�des Difficile � r�aliser Souvent l�tale

27. Pr�l�vement Pr�lever dans la veine marginale Veine de la queue (souris)

28. Cin�tique de production d�un immun s�rum

29. R�ponse immunitaire

30. R�ponse primaire Phase de la latence Activation du syst�me immunitaire Croissance exponentielle Production des anticorps IgM, puis IgG D�croissance R�gulation de la r�ponse immunitaire

34. R�ponse secondaire Pas de phase de latence Intensit� plus forte Dur�e plus longue

38. Purification �limination des prot�ines non immunologique M�thodes physico-chimique Centrifugation/filtration Pr�cipitation par les sels neutres Chromatographie Affinit� de groupe, prot�ine A ou prot�ine G Affinit� sp�cifique, l�antig�ne

39. �lectrophor�se du s�rum

40. Centrifugation/Filtration �limination des d�bris cellulaires : centrifugation Petits volumes 10 000 g pendant 15 min Lysats cellulaires 40 000 � 50 000 g pendant 30 min �limination des petites particules : filtration Membrane de PVDF porosit� de 0,22 � 1 �m

41. Lipoproteines Colmatage des colonnes de chromatographie Parfois pr�sente en fortes concentrations : Liquides d�ascite Pr�cipitation en pr�sence de sulfate de Dextran En pr�sence de polyvinylpyrrolidine (PVP) � pH 7.0 �limination du pr�cipit� par centrifugation

42. Pr�cipitation

43. Agents pr�cipitants

44. Dessalage

45. Chromatographie

46. Chromatographie d�affinit�

47. Colonnes de chromatographie

48. Chromatographie d�affinit� de groupe Prot�ine A Extraite de staphylocoque aureus Prot�ine G Extraite du streptocoque du groupe G Liaison avec le fragment Fc de l�immunoglobuline

51. Chromatographie d�affinit�, r�f�rences internet Tutorial anim� illustrant la chromatographie d�affint� http://www5.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LC-tech+Affinity+Chromatography Cours sur la chromatographie http://www1.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/LabSep+Education+Centre Handbook Chromatographie d�affinit� Purification d�anticorps