Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia

1. Universidade Federal de Santa Catarina Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia Disciplina: Processos Biotecnológicos Potencial biotecnológico de aplicação de Pichia pastoris em escala industrial Dianne Galiotto

2. Pichia pastoris • Levedura metilotrófica, ou seja, capaz de crescer em meio de cultura contendo metanol como única fonte de carbono • Ao longo das últimas duas décadas, têm sido apresentada como sistema alternativo de expressão heteróloga de várias proteínas eucarióticas de interesse comercial

3. P. pastoris cujo sistema de expressão foi engenheirado, mostra-se como uma eficiente hospedeira para a síntese e secreção de PROTEÍNAS HETERÓLOGAS para aplicações acadêmicas ou industriais (COS et al., 2005)

4. Grande interesse existente no estudo das leveduras deve-se ao fato que... • Se trata de organismos eucariotos “inferiores” e, como tais, possuem organização celular similar à dos eucariotos “superiores” • Além disso, muitas proteínas de leveduras são similares, estrutural e funcionalmente, às suas homólogas em mamíferos Marques, 2006

5. A expressão de proteínas heterólogas em leveduras, tem atraído a atenção, por combinar a facilidade de manipulação genética e as características de crescimento de organismos procariotos permitindo seu cultivo em escala industrial (SMITH et al., 1985)

6. Entretanto, ... • A escolha de um sistema de expressão deve ser feita de forma a obedecer alguns critérios

7. Características desejáveis da célula hospedeira para produção de proteínas heterólogas • Crescimento rápido • Relação custo/rendimento • Não ser nocivo ou patogênico • Ser estável em cultura • Ser capaz de receber DNA exógeno

8. Comparação entre os sistemas mais utilizados para expressão de tempo/custo/rendimento dos principais sistemas de expressão utilizados Fonte: Lemes, 2004.

9. Relação custo/rendimento em diferentes sistemas de expressão. Fonte: Lemes, 2004.

10. Preferência por este sistema particular de expressão pode ser atribuído a diversos fatores:

11. Manipulação genética simples • Crescimento rápido • Baixo custo de cultivo • Alta densidade celular • Forte não fermentadora • Produção proteínas heterólogas em grande quantidade, intra e extracelularmente • Capacidade de realizar várias modificações pós-traducionais características de eucariotos, tais como O e N-glicosilação • Forte promotor Cereghino & Cregg, 2000

12. Baixo custo de cultivo • O meio de crescimento de P. pastoris na produção de proteínas recombinantes é definido, de baixo custo e ideal para produção em alta escala • Consiste de uma única fonte de C (glicerol ou metanol) Fonseca, 2006

13. Alta densidade celular • São facilmente cultivadas até atingir níveis muito altos de densidade celular ~ 100 g de peso seco celular por litro, ou até maiores Marques, 2005

14. Não fermentadora • A fermentação realizada pelas leveduras gera etanol, que em culturas de alta densidade pode rapidamente atingir níveis tóxicos (Efeito Crabtree), o qual limita o crescimento da levedura e a produção de proteína • Por sua preferência por crescimento respiratório, P. pastoris pode crescer em altos níveis e assim aumentar a produção de proteínas secretadas [proteínas] ~ [células na cultura] Cereghino & Cregg, 2000

15. Exemplo: • Produção de 10 g/L de albumina sérica humana (Kobayashi et al., 2000) enquanto em S. cerevisiae a produção é de150 mg/L (Sleep et al., 1991)

16. Proteínas extracelularmente • As leveduras, secretam para o meio extracelular o produto de interesse, sem ter seus componentes intracelulares liberados para o meio • * Ao contrário da maioria das bactérias que retém a proteína intracelularmente, sob a forma de corpos de inclusão acarreta em: ALTOcusto de purificação do produto desejado

17. Modificações pós-traducionais • O sistema de expressão P. pastoris utiliza um sinal de secreção para secretar as proteínas heterólogas através da via de endomembranas, o que permite modificações pós-traducionais, como a maturação proteolítica, a glicosilação e dobramento natural (VOZZA et al., 1996)

18. Em muitas leveduras as cadeias de oligossacarídeos das proteínas são alongadas pela adição de resíduos de manose • Em S. cerevisiae essas cadeias consistem de 150 resíduos de manose, com ligações α-1,3 • Em P. pastoris,a adição desses resíduos é muito menor e similar às deposições de manose feitas por células de mamíferos e não há ligações α-1,3 o que torna as proteínas menos imunogências (VOZZA et al., 1996) característica favorece P. pastoris como hospedeira alternativa para expressão e secreção de proteínas de eucariotos

19. Forte promotor • Genes heterólogos podem ser expressos em P. pastoris colocando-os sob o controle do promotor AOX1, derivado do gene da enzima álcool oxidase (AOX I) • Isso tem se mostrado simples, fácil de ser realizado em grande escala e de custo compatível para a fermentação industrial (Cregg et al., 1993) Promotor regulado transcricionalmente por metanol, um indutor relativamente barato

20. Em células expostas a metanol como única fonte de carbono, o início da transcrição no promotor AOX1 é altamente eficiente (Moraes & Torres) transcritos do gene AOX1 perfazem 5% do RNA poli(A) total • A enzima AOX1, a primeira enzima na via de utilização de metanol, é superexpressa e constitui cerca de 70% do total de proteínas solúveis nas células • Promotor forte podendo ser eficientemente empregado para controlar a expressão de genes exógenos (Gellissen et al., 2005)

21. Uma vez que o promotor AOX1 é controlado pela manipulação da fonte de carbono adicionado ao meio de cultura, o crescimento e a indução de cepas de P. pastoris, que expressam proteínas heterólogas, são facilmente obtidos em todas as escalas, desde frascos até grandes fermentadores (Moraes & Torres)

22. Ainda..

23. P. pastoris não apresenta problemas como produção de endotoxinas como ocorre com bactérias, nem problema de contaminação viral encontrados na expressão de proteínas produzidas em cultura de células animais (Lin Cereghino et al., 2001)

24. P. pastoris x bactérias • Bactérias não possuem sistema de endomembranas e não realizam modificações pós-traducionais, o que pode impedir o correto processamento de proteínas eucariotas (CREEG, 1999)

25. P. pastoris x S. cerevisiae • S. cerevisiae apresenta algumas limitações, como a alta glicosilação, tornando a proteína imunogênica, ou de conformação não-funcional; produção de etanol durante a fermentação que pode ser tóxico (CREEG et al., 1993)

26. P. pastoris x células animais • P. pastoris: simplicidade no cultivo e nos processos de fermentação • Células animais: requerimentos nutricionais complexos, fragilidade estrutural da membrana (sujeita a cisalhamento), baixa velocidade específica de crescimento

27. Aplicações • Produção de estreptavidina recombinante pela levedura Pichia pastoris • Produção da Fructosiltransferase de Pichia pastoris através da fermentação submersa • Avaliação da Estabilidade Genética de Pichia pastoris GS 115 na Produção de Xilanase • Expression of human cathepsin K in Pichia pastoris and preliminary crystallographic studies of an inhibitor complex • Overexpression of Human Procarboxypeptidase A2 in Pichia pastoris and Detailed Characterization of Its Activation Pathway

28. Ufa, até que enfim acabou!!!!

29. Desvantagens • Secreção ineficiente de proteínas complexas • Poucos vetores disponíveis