A membrántranszport molekuláris mechanizmusai

1. A membrántranszport molekuláris mechanizmusai II. A membrántranszport alapjai Dr. Horváth Ferenc SZTE, Növénybiológiai Tanszék

2. A membrántranszport alapjai 1. Áttekintés A membrán gátat képez hidrofil molekulák átjutására Runar Collander (finn, 1930-as évek) a molekulák biológiai membránokon való átjutása arányos a molekula olaj:víz megoszlási hányadosával. Mivel a molekulák különböző tömegűek (Mr), a mozgásukat a méret is befolyásolja. Korrekciós faktor. Egyenes arányosság a membránon való átjárhatóság és a lipofilitás között. Kísérlet • Chara tomentosa – sejtfürdőbe: töltés nélküli szerves vegyület • az inkubáció után az adott anyag sejten belüli mennyisége = a külső mennyiségével • az equilibrium elérésének ideje változik • Definíció: permeabilitási koefficiens (Ps) Ahol t0,5 az equilibrium eléréséhez szükséges idő fele, V a sejt térfogata A a sejt felülete.

3. A membrántranszport alapjai 1. Áttekintés Kontrollált membrántranszport integráns membránfehérjéken enzimeknek tekinthetők (szubsztrát-specifitás, a transzport aktivációs energiáját csökkentik), de a katalizált reakció vektoriális és nem skaláris Integráns membránprotein – hidrofób aminosav szekvencia szakaszokat tartalmaz – a zsírsav oldalláncokkal lép reakcióba Hidropátia analízis: megmutatja, melyik rész ágyazódik a membránba az a-hélix minimum 20 AS-at tartalmaz (0,15 nm emelkedés / AS; PM: 3 nm) Hidropátia index: AS vízben való oldhatósága (+4,5 -4,5) Venni kell egy 19 AS-as „ablakot” ha az átlagos HI > 1,6, akkor az transzmembrán domén. KAT1

4. A membrántranszport alapjai 1. Áttekintés A membrántranszport szerepe Turgor kialakítása: a sejtfal segítségével a növényi sejtek nem robbannak fel híg közegben – pozitív nyomás főként a K+ akkumulációja gerjeszti (citoplazma, vakuólum) halofitáknál (sótűrő) Na+ az elektroneutralitás megőrzése miatt az ellenion: Cl- és malát Tápanyagok akkumulációja: a talajból a gyökérsejtek segítségével esszenciális elemek: nitrogén – NH4+, NO3-, foszfor – H2PO4-, kén – SO42- nyomelemek: bór, cink, réz, vas – specifikus transzporterek Melléktermékek eltávolítása: a citoplazmából való kivonás a H+ a legfontosabb – proton pumpák a PM és tonoplasztban OH- is – a HCO3- és NO3- ionokat szerves molekulákba beépítő növényeknél Anyagcsere termékek elosztása: floém – szacharóz és aminosavak szállítása a szintézis helyétől a felhasználás helyéig Anyagcsere termékek kompartmentalizálása: a raktározó és lebontó folyamatok térbeli elkülönítése pl. amiloplasztiszokban keményítő raktározás – citoszolban glikolízis pl. mitokondriumban mesterségesen nagy ADP/ATP és NADH/NAD+ arány a légzés hatékonysága miatt Energia-transzdukció: fényenergia – fotoszintetikus e-transzport – tilakoid lumenében a protonok száma nő vagy mitokondrium NADH oxidálása – protonok jutnak a mátrixból az intermembranális térbe eredmény: a protonok visszajutásával ATP-szintézis Szignál-transzdukció: növekedés és fejlődés során abiotikus és biotikus szignálok átvitele: a citoplazmatikus szabad Ca2+ koncentrációjának emelkedése – Ca2+-csatornák visszacsökkenés: PM, belső membránok – Ca2+-ATPáz

5. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Az anyagtranszportot négyféle hajtóerő mozgatja: koncentráció, hidrosztatikus nyomás, (gravitáció) és elektromos mező μj - j anyag (elektro)kémiai potenciálja μj0 – j anyag standard kémiai potenciálja R – egyetemes gázállandó (8,314 J mol-1 K-1) T – abszolút hőmérséklet (K) a – aktivitás, töltés nélküli oldatoknál: Cj moláris koncentráció Vj – j anyag parciális moláris térfogata P – hidrosztatikai nyomás z – az anyag töltése F- Faraday állandó (96500 coulomb / mol proton) E – elektromos potenciál A kémiai potenciál mértékegysége a J mol-1.

6. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Passzív transzport: A sejt nem fektet be metabolikus energiát az anyag felvételére. 1. A transzport hajtóereje: két pont között fennálló kémiai potenciál különbség →DIFFÚZIÓS MOZGÁS Passzív transzporttal mozog: a víz gázok: oxigén, széndioxid, N oxidok, kéndioxid stb. lipidoldékony, apoláros anyagok (benzin, szénhidrogének, aromás szennyeződések), ionok (bizonyos esetekben)

7. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Elektromosan töltetlen anyagok kémiai potenciálja S anyag kémiai potenciálja: , ahol R – egyetemes gázállandó (8,314 J mol-1 K-1) T – abszolút hőmérséklet (K) a – aktivitás, töltés nélküli oldatoknál a moláris koncentráció. - standard kémiai potenciál A kémiai potenciál mértékegysége a J mol-1. Két vizes teret határoló membrán esetén: A kémiai potenciál különbsége: Ez a koncentráció-különbségben raktározott energia. Mindig a citoplazmához viszonyítunk.

8. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése A transzport iránya DmS előjele fontos, ha pozitív – a citoplazmába irányuló S influxa energiaigényes negatív – a citoplazmába az S anyag passzív módon jut 0 – nincs koncentráció-különbség

9. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Vegyünk egy z töltéssel rendelkező iont (I): Elektrokémiai potenciál membránpotenciál

10. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Aktív transzport A sejt metabolikus energiát fektet be az anyag felvételéhez. Elsődleges aktív transzport:ionpumpák Növényekben a proton-transzlokáló ATP-ázok (H+-ATP-áz) - lokalizáció: plazmamembrán, vakuólum membrán (tonoplaszt) - az ATP hidrolízisével felszabaduló energiát a proton sejtfalba ill. vakuólumba irányuló transzportjára használja; Eredmény: proton elektrokémiai potenciál gradiens  proton mozgató erő (pmf) Másodlagos aktív transzport: A pmf felhasználása más anyagok transzportjában - ezek a transzporterek lehetnek hordozók és csatornák

11. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Proton mozgató erő (pmf): a protonra vonatkozó transzmembrán elektrokémiai potenciálkülönbség, voltokban kifejezve z = +1 A pmf-et voltokban fejezzük ki és nem J/mol egységekben, így Tehát 1 pH egység különbség 59 mV elektrokémiai potenciálváltozást jelent a protonmozgató erőben!

12. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése pH: 7,5 Vm = -150 mV DpH = 2 pmf = -268 mV pH: 5,5 A protonpumpák működése elektrogén: nem csak a pH különbség előállításán keresztül növelik a pmf abszolút értékét, hanem a Vm értékét is negatívabbá teszik. Proton recirkuláció hajtja a hordozó molekulák által közvetített anyagtranszportot, a citoszolból kifelé és befelé egyaránt, közben a pmf felhasználódik. Proton kotranszport: a citoszol felé szimporterekkel, a citoszolból kifelé (apoplaszt tere vagy organellumok tere) antiporterekkel kerül az anyag.

13. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Kemiozmotikus hipotézis Peter Mitchell 1960-as évek (Nobel díj, 1978). Mitokondrium és kloroplasztisz: Proton-gradiens energiája ATP szintézisére használódik. PM, TP: ATP és PPi hidrolízisének energiájából proton-gradiens alakul. Az így létrehozott elektrokémiai potenciálkülönbség mozgatja az ionokat és kisebb molekulákat a hordozókon és csatornákon keresztül. A transzport irányát a transzporterre ható hajtóerő szabja meg. A hajtóerő a szabadenergia különbségből (transzmembrán potenciálból) adódik. Nem töltött anyag esetén: kémiai potenciál különbség Dm, [kJ/mol] Ionok esetén: kémiai potenciál különbség + elektromos potenciál különbség (membrán potenciál Vm) 

14. A membrántranszport alapjai 2. A membrántranszport szerveződése Ioncsatornák: a rajtuk átáramló ionok mozgásirányát az adott ionra ható elektrokémiai mozgatóerő befolyásolja. Pmf nincs közvetlen hatása, csak a Vm membránpotenciálon keresztül. Az ionpumpák átviteli száma kicsi, és pmf-et generál a hordozók számára is, ezért jóval nagyobb a koncentrációja a membránban, mint a csatornáké. A P-típusú H+-ATPáz tisztítása SDS-poliakrilamidgélelfó segítségével spenót levélből: A membránfehérjék közül a pumpa mennyisége számottevő.

15. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák Pumpák F-típusú H+-ATPázok belső mitokondriális és tilakoid membrán P-típusú H+-ATPázok gomba PM H+-ATPáz növény PM H+-ATPáz Na+ / K+ ATPáz (állati sejtek) Ca2+-ATPázok (növény és állat PM és endomembránok) H+ / K+ cserélő ATPáz (emlős gyomor mucosa réteg) V-típusú H+-ATPázok Vakuoláris proton pirofoszfatáz (H+-PPáz) ABC-típusú pumpák

16. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák F-típusú H+-ATPázok • a belső mitokondrális membránon és a tilakoid membránon találhatók • a proton-pumpáló elektrontranszport-láncok a redoxpotenciál ill. a fény energiáját használva pmf-t állítanak elő • a pmf hajtja a H+ áramlást az F-típusú ATPázon keresztül  ATP szintetizálódik F1 (mitokondrium) CF1 (kloroplasztisz) alegység a3b3gde 3 db b alegység: 3 nukleotidkötő domén F0 (mitokondrium) CF0 (kloroplasztisz) alegység ab2c9-12 A c alegységek forognak a proton transzlokáció során, ami a g alegységet pörgeti, így a b nukleotidkötő helyek konformációváltozást szenvednek..

17. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák John Walker és Paul Boyer, Nobel díj 1997: Gyenge kötődés: az aktív centrum gyengén köti az ADP-t és Pi-t Erős kötődés: az ATP molekula kialakul Nyitott konformáció: ATP leválás 3 db H+ átjutása alatt szintetizálódik 1 ATP molekula.

18. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák P-típusú ATPázok családja 1 db 100 kDa-os protein, ATP-t köt és H+ transzportot katalizál Funkciói: - pmf (Vm) generálása (hordozók és ioncsatornák) - sejtfal savanyítás (auxin hozzáadása után 2 perccel!)  expanzin enzimek aktiválódnak, amelyek a H-kötéseket lazítják – sejtfal növekedés - H+ eltávolítása a sejtből (anyagcsere folytonosan termeli) - a citoszol pH-jának szabályozása (7,3-7,5): a H+-ATPáz pH-optimuma 6,6, tehát ha savas a közeg, akkor jobban működik Hatékonysága: 1 proton / 1 MgATP hidrolízise Reakcióciklus: E1 konformáció – H+ kötődik hozzá E2 konformáció – ATP hidrolízise így a foszfát-csoport enzimhez való kapcsolódása eredményezi. E2 alacsony affinitású a H+-ra nézve, így az a másik oldalon disszociál. Az enzim-foszfát hidrolízise viszi az enzimet vissza E1 konformációba.

19. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A foszfátcsoport kovalens kötődése (E-P) megkülönbözteti az F-típusú ATPázoktól. Az enzimcsalád tagjai: gomba PM H+-ATPáz növény PM H+-ATPáz Na+ / K+ ATPáz (állati sejtek) (Skou, Nobel díj, 1997) Ca2+-ATPázok (növény és állat PM és endomembránok) H+ / K+ cserélő ATPáz (emlős gyomor mucosa réteg) Közös tulajdonságok: ortovanadáttal (H2VO4-) való gátolhatóság domén struktúra azonossága (főleg az ATP-kötő domén konzervált a különböző pumpák között) ATP-kötődomén D – aszparaginsav (foszforilálódik) A defoszforilációban résztvevő hurok Autoinhibíciós domén

20. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A P-típusú ATPázokat egy multigén-család kódolja, mely szövetspecifikus expressziót mutat Arabidopsis (lúdfű) esetén AHA géncsalád (10 tag, 10 izoformát kódol) pl. AHA3 – floém AHA10 fejlődő magvak Magyarázat: más és más az ATP-re vonatkozó KM érték, más az ortovanadátra való érzékenység • Szövetspecifikus P-típusú ATPázgénexpresszió Arabidopsisban. • szárkeresztmetszet, az AHA3-c-Myc fúziós protein immunofluoreszcens kimutatása P – floém, C – kortikális sejtek, X – xilém • AHA10 gén promóterének expressziója fejlődő magvakban, b-glükuronidáz (GUS) festéssel. • A nyilak két magot mutatnak a becőtermésben. A kék szín az AHA10-GUS fúziós protein termelődését mutatja.

21. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A P-típusú ATPázok szabályozása - pH-tól való függés - a C-terminális autoinhibíciós domén (ennek eltávolítása vagy pontmutáció benne módosítja az enzim működését) - az auxinnak hatása a pumpa expressziójának növelésében van A fuzikokcin (Fusicoccum amygdali gomba toxinja) – növeli a zárósejtek turgorát  sztómanyitódás, levélszáradás 1994 – a fuzikokcin receptora a szignál-transzdukciós proteinek családjából való 14-3-3 protein 14-3-3 proteinek – dimerek, melyek a célproteinre (foszforilált szerin reziduálist tartalmaz) vonatkozó konszenzus szekvenciával rendelkeznek

22. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A C terminus autoinhibíciós doménként viselkedik. A szerin foszforilációja és a kötődő 2 db 14-3-3 protein megszünteti a gátlást és aktiválja az enzimet (balra) Az enzimet foszforiláció híján a fuzikokcin+ 14-3-3 proteinek is aktiválhatják

23. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák Na+ / K+ ATPáz (állati sejtek)

24. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A Ca2+-ATPáz Megtalálható: PM, ER, kloroplasztisz membrán, vakuoláris membránok Ca2+-ot pumpálnak ki a citoszolból, [Ca2+]cyt = 0,2 mM Állati sejtekben részletesen tanulmányozott pumpák: A Ca2+ átjuttatásához sok energia kell, mert: - kint több Ca2+ van mint a citoszolban - a citoszol elektromosan negatívabb, mint a külső oldal A Ca2+ eletrokémiai potenciálkülönbségéből származó szabadenergia: -60 kJ/mol Az ATP hidrolíziséből származó szabadenergia: -50 kJ/mol, ami nem elég a pumpa működtetéséhez. Gyakran Ca2+ / H+ cserélőként működik! Vakuoláris PM-típusú Ca2+-ATPáz

25. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A vakuoláris (V-típusú) H+-ATPázok csoportja Funkciója: a vakuoláris tér savanyítása kb. pH 5,5-ös értékre (citrusfélék gyümölcsének esetén ez akár pH 3 alatt is lehet) nemcsak a hordozók számára energizálja a membránt, de sok vakuoláris enzim (proteázok, glükozidázok, foszfatázok, nukleotidázok) pH optimuma savas Az F-típusú ATPázok rokonai, de fordított irányban működnek. Sokkal összetettebb alegység szerkezet, mint az F-típusnál. Sztöchiometria: 2 db H+ transzlokáció / 1 ATP hidrolízis Gátolhatóság: bafilomicin A1, a V0 szektorral lép kölcsönhatásba Előfordulása: tonoplaszt, ER, Golgi, burkolt vezikulumok membránja (a mitokondriumon és a kloroplasztiszon kívül minden organellum képes fenntartani a savas belső terét. V1 V0

26. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák A bafilomicin szerkezete. A Streptomyces fajok által termelt toxin a V-típusú ATPáz specifikus gátlószere.

27. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák Vakuoláris proton pirofoszfatáz (H+-PPáz) A szervetlen pirofoszfát (PPi) hidrolíziséből felszabaduló energiát hasznosítja Szerkezete: egyszerű, kicsi (80 kDa)-os fehérje, 16 transzmembrán szegmenssel Szubsztrátja a dimagnézium-pirifoszfát (citoplazmában mM-os nagyságrendben) Gátolhatósága: Ca2+, aminometilén-difoszfonát, a működéséhez a citoplazmatikus felszínnél K+ ionoknak kell jelen lenni Miért van szükség kétféle protonpumpára a tonoplaszton? Fiatal sejtekben sok PPi termelődik  a hidrolízise során felszabaduló hő helyett az energia inkább a pmf létrehozásában hasznosul

28. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák ABC-típusú pumpák Az amfipatikus molekulák vakuoláris membránon való átjutását katalizálják pl. flavonoidok, antocianinok, a klorofill lebontási melléktermékei, xenobiotikumok (herbicidek). Az átjutáshoz ATP szükséges, a transzport viszont nem csökkenti a pmf-t. ABC = ATP binding casette – elterjedt az enzimek között, melyek ATP-t kötnek. Walker A és B motívum NBF = nucleotide-binding fold (2 db van belőle) Sok transzmembrán szegmens

29. A membrántranszport alapjai 3. Pumpák ABC-típusú pumpák A flavonoidok és xenobiotikumok glutation-konjugátumként (GS-konjugátumok) transzlokálódnak. GS=tripeptid (glutaminsav+cisztein+glicin) Glutation S-transzferáz(GST) enzim végzi a konjugátum-képzést. Az ABC-transzporterhez való kötődés után 1, pumpaszerű működés, vagy 2, flippázszerű működés. Nem tisztázott. glutation (GS) AtMRP2 – Arabidopsis ABC-transzporter DNP – dinitrofenol (xenobiotikum) NCC – lineáris tetrapirrol Bn – Brassica napus

30. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók pmf H+ anyag szimport v. antiport Hordozók uniport uniport – elektrokémiai gradiensen lefelé (facilitált diffúzió) kotranszport – elektrokémiai gradiensen fölfelé szimport antiport Másodlagos aktív transzport: az elsődleges aktív transzportban generált pmf használódik fel az anyag energiaigényes transzportjára Energiát szolgáltatja: pmf (H+), Na+ és több töltés nélküli anyag is

31. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A hordozók működése Michaelis-Menten kinetikát mutat, mely konformációs változásra utal - a transzport alatt nem történik kémiai módosulás, - a transzport kinetikája szubsztráttal való telítődést mutat - a Michaelis-Menten kinetikával kezelhető v = vmax [S] / (KM + [S]) A maximális sebesség felénél mérhető szubsztrát koncentráció a Michaelis-Menten állandó (KM) szubsztrát Lineáris szakasz: Alacsony S koncentráción az S hordozóhoz való kötődése alakítja a kinetikát Magasabb S koncentráción a konformációs változás, a kötőhelyhez való hozzáférhetőség a limitáló tényező

32. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A másodlagos aktív transzport molekuláris mechanizmusa (itt szimport esetén)

33. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók Másodlagos aktív transzport: szimport és antiport A kotranszportált anyag lehet semleges és töltéssel rendelkező is

34. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók - A kálium felvétele nagy affinitású rendszer: K+-H+szimport (1:1) HKT1 (534 aminosav protein) μM [K+]ext tartományban gyökér kortex sejtekben alacsony affinitású rendszer: befelé egyenirányító ioncsatornák 1 mM [K+]ext fölött Vm-hajtotta K+ influx (H+-ATPáz!) Al3+ ionok gátolják

35. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A hordozók működésének kinetikai és fizikai modellje C – hordozó, o – extracelluláris oldal, i – intracelluláris oldal, S - szubsztrát A kötőhely pozíciója nem módosul, csak a konformáció változik meg.

36. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók • A transzportált anyagok sokfélék lehetnek, • a hordozók erősen szubsztrát-specifikusak. • PM: • NH4+, NO3-, Pi (H2PO4- formában), K+, SO42-, Cl- • szerves anyagok: aminosavak, purin és pirimidin bázisok • nem csak a tápanyagfelvételben, de pl. floém feltöltésben is szerepük van • a fejlődő szövetekbe való cukor és aminosavak mobilizálása • Tonoplaszt: • Na+, Mg2+, Ca2+, NO3-, szacharóz, aminosavak • Kloroplasztisz: • triózfoszfát-ortofoszfát transzlokátor (dihidroxiaceton-foszfát (DHAP) kifelé – Pi befelé), így az újonnan fixált, citoplazmába kijutó szén nem okoz foszfáthiányt a kloroplasztiszban • Mitokondrium: • mátrix ATP – citoszol ADP csere, így a mitokondriumban több ATP tud szintetizálódni • A hordozóknak erős szubsztrát-specifitásuk van • izomerek között is különbséget tesznek (L-, D-), így nagyon sokféle hordozó van

37. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók pmf H+ A legtöbb növényi hordozót a pmf energizálja – protonhoz kapcsolt kotranszport • Ekkor a szubsztrát molekula a saját elektrokémiai potenciálgradiensével szemben transzportálódik • ezt két kísérlet bizonyította: szimport v. antiport V Az elektród a plazmamembrán membránpotenciálját (Vm) méri szulfát anion hozzáadásával a Vm emelkedik (depolarizáció), jelezve a H+ kotranszportot (monovalens anionnal 2 H+, divalens anionnal 3 H+ jut be). A fürdőoldat közben lúgosodott. A transzportrendszer elektrofór, mert nettó elektromos töltésáramlást keltett. Kalcium izotópos fürdőoldatba helyezett vezikulákat szűrtek le szűrőpapíron, majd mérték a sugárzást. Ca-ionofór – átjárhatóvá teszi a membrán a kalcium számára: nem kívülről kötődött a membránhoz, hanem akkumulálódott. FCCP – megszünteti a proton-gradienst. Ca2+-H+ Antiport

38. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók Más, nem ionhoz kapcsolt kotranszport Tonoplaszt: glükóz és aminosav hordozók Kloroplasztisz: 2-oxoglutársav-almasav, ATP-ADP, hexóz-foszfát-ortofoszfát, DHAP-ortofoszfát Ekkor a transzportált anyag koncentráció-gradiense szolgáltatja az energiát.

39. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók • A hordozók szerkezete és tanulmányozásuk lehetőségei • Csak élesztő komplementációs kísérletekkel és heterológ expressziós rendszerekben (pl. oociták) lehet tanulmányozni • Transzport mutáns élesztőbe visznek növényi cDNS-t, így azok az anyagot fel tudják venni • így az összes 1 alegységes hordozót meghatározták (a cDNS-t tartalmazó vektor 1 alegység génjét tartalmazza) • méretük 40-50 kDa, többnyire hidrofób fehérjék • általában 12 transzmembrán domén, a 6-7 között erősen hidrofób loop • több belső repeat szekvencia a C és N-terminálisfélben (az idők során génduplikáció történt) • MFS (main facilitator superfamily)-ba tartoznak, mely nagy és erősen diverz csoport

40. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A hordozók aktivitását elektrofiziológiai mérésekkel is meg lehet vizsgálni, mert az elektrofór transzport függ a membránpotenciáltól. Ehhez az élesztő nem alkalmas, mert pici és erős kitines sejtfala van. Az oociták nagyméretű sejtek, melyeknek gyenge endogén transzport-aktivitásuk van Könnyen transzfektálhatók: a növényi cDNS vektorba csomagolva mikroinjektálással bejuttatható. cDNS – cRNS – majd transzport aktivitás 2-4 nap múlva mérhető

41. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A hordozók lokalizációját legkönnyebben immunofluoreszcenciás eljárással lehet megállapítani. Példa: szacharóz-H+ szimporter elhelyezkedése Plantago és Arabidopsis fajokban a SUC2 protein csak a kísérősejtekben expresszálódik  pmf-t a P-típusú ATPáz, az AHA3 izoforma generálja a szacharóz feldúsul a kísérősejtben és a plazmodezmákon keresztül jut a rostacső- elemekbe (floémfeltöltés) Solanaceae – a SUT1 szacharóz szimporter a rostacső elemekben van, nincs a kísérősejtben. Sőt a SUT1 mRNS-t is megtalálták a rostacső elemekben, melyek sejtmagot nem tartalmaznak. Az mRNS a plazmodezmákon jut át. A SUT1 lokalizációja a rostacső elemekben (se). (A) Burgonya szár hosszmetszet vörös immunofluoreszcens festékkel. (B) Keresztmetszet.. A SUC2 immunofluoreszcenciás jelölése Arabidopsis szárban. A xilém autofluoreszcens jelet produkál. (B) Ugyanez fénymikroszkópos felvételen.

42. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók pmf H+ Sz Reakció: e c n: sztöchiometriai arány z: átvitt anyag töltése szimporter A reakció akkor játszódik le balról jobbra (akkor juttat a szimporter befelé protont és S anyagot), ha a két elektrokémiai potenciálgradiens vektori összege befelé mutat, azaz (a citoplazmához viszonyítunk) Kifejtve a két potenciált: adódik:

43. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók Ha pl. pHcyt = 7,5 pHextracell = 5,5 akkor az anyag maximális felhalmozódási aránya: Ha pl. S töltés nélküli anyag, és 1 protonnal transzportálódik, akkor n = 1 esetén Vm= -150 mV mellett a max. felhalmozódási arány 36500. n=2 esetén ez 1,34 x 109 ! Tehát a protonhoz kapcsolt hordozók nagy koncentrációkülönbséget képesek létrehozni, szabályozásuk nagyon fontos.

44. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók A hordozók szabályozása Transzkripcionális szinten derepresszált mód – szubsztráthiány esetén, represszált mód magas szubsztrát-ellátottság után AtKUP3 Arabidopsis K+ hordozója, mely a K+ felvételét bonyolítja a gyökérben. Poszt-transzlációs szinten Chara internodális sejtjének membránján alacsony citoszolikus Cl- koncentráció esetén erős H+-Cl- szimporter aktivitás. Ha a [Cl-]cyt felemelkedik 10 mM fölé, akkor a citoszolikus Cl- kötődik a hordozó kötőhelyéhez és blokkolja működését. Transzinhibíció jelensége.

45. A membrántranszport alapjai 4. Hordozók Néhány esetben a hordozók működése nem H+-hoz hanem Na+-hoz kötött. Tengerben élő algafajok esetén az NO3- és néhány aminosav felvétele Na+-hoz kötött szimportot mutat. Tengervíz 480 mM Na! Édesvizi algáknál a Na/K szimport is lehetséges, a Na-ra vonatkozó nagy Vm komponens miatt. Búzában is megtalálták: HKT1 high-affinity K+ transporter a gyökér kortexében.