LE CYCLE CELLULAIRE

1. LE CYCLE CELLULAIRE

2. III - Contrôle intra-cellulaire des événements du cycle cellulaire

3. Complexe Cdk - cycline = facteur de déclenchement des événements du cycle • Comment ? • Dans le bon ordre • Une seule fois par cycle • Quatre événements • Réplication de l’ADN en phase S et blocage de la re-réplication • Entrée en phase M • Séparation des chromatides • Sortie de la mitose Objectif

4. Complexe S-Cdk = • Cycline A + Cdk2 chez les vertébrés • Clb 5, 6 + Cdk 1 chez la levure • Complexe M-Cdk = • Cycline B + Cdk 1 (ex Cdc 2 !) chez les vertébrés • Clb 1, 2, 3, 4 +Cdk 1 chez la levure • Anaphase Promoting Complexe (APC) Les trois grands acteurs

5. Quatre événements, quatre acteurs, quatre paragraphes

6. Table 17-1 Composition de S-Cdk et M-Cdk des vertébrés et des levures bourgeonnantes

7. A - Complexe S-Cdk Réplication de l’ADN en phase S et blocage de la re-réplication

8. G1 + S  G1 se réplique  S contient S-Cdk • G2 + S  Pas de synthèse d’ADN en G2 • G2 + G1  Pas de synthèse d’ADN en G1 Expériences de fusion cellulaire

9. Fig 17-21 Expériences (1970) de fusion cellulaire

10. Origin Recognition Complex (ORC) Gros complexe multiprotéique qui se fixe sur l’origine de réplication (chez la levure) Puis addition de nombreuses protéines régulatrices supplémentaires dont Cdc 6

11. Taux bas pendant le cycle cellulaire Augmentation transitoire en début de G1 Se fixe à ORC Nécessaire à la liaison de protéines proches, les Mcm Cdc 6

12. Protéines Mcm(Minichromosome Maintenance) Maintien des minichromosomes circulaires dans la levure (en fait des plasmides) Se fixent à ORC grâce à Cdc 6 ORC + Cdc 6 + Mcm = pre-replicative complexe

13. Initialisation de la synthèse d'ADN, depuis le recrutement jusqu'à l'activation du complexe MCM Fig. 1. Initiating DNA synthesis, from recruitment to activation of the MCM complex. (A) Assembly of the pre-RC begins during the G1 phase, when Cdc6 and Cdt1 are recruited to replication origins to which ORC and Mcm10 bind. (B) Cdc6 and Cdt1 facilitate the loading of the MCM complex. Anchoring of the MCM complex is mediated through interaction between individual subunits of the MCM complex and multimers of the Mcm10 protein. Cdc6 is removed from origins once the MCM complex is recruited. The Cdc7-Dbf4 kinase is also recruited to the origin during G1 phase. (C) Phosphorylation of the MCM complex by Cdc7-Dbf4 occurs during S phase and is controlled locally at individual origins. Phosphorylation of the MCM complex is coupled to a conformational change in the complex that results in the melting of origin DNA. ORC and Mcm10 are hidden from view. (D) This conformational change is believed to convert the inactive MCM complex into the enzymatically active helicase, whose ring-shaped structure becomes topologically linked to DNA (Tye and Sawyer, 2000). Recruitment of Cdc45 requires both the phosphorylation of the MCM complex and the activity of CDKs. Disassociation of the MCM helicase by Cdc45 from the Mcm10 anchor initiates the melting of DNA and recruits RPA, DNA polymerase a, and primase to the origins for the initiation of DNA synthesis. (E) The melting of the dsDNA induces a conformational change in ORC before replication origins assume a post-replication chromatin state. Like the ORC, Mcm10 is believed to remain bound to origins throughout the cell cycle. Lei,M2001p1447: Initiating DNA synthesis: from recruiting to activating the MCM complex.J Cell Sci 2001,114

14. A Model for Mcm2-7 Loading by the ORC and Cdc6 ATPases • ATP bound ORC first binds origin DNA. Cdc6 then binds ORC and ATP. Cdt1 and Mcm2-7 (possibly as a complex) associate with ORC and Cdc6 at the origin. ATP hydrolysis by Cdc6 leads to the loading of Mcm2-7 complexes on DNA and the release of Cdt1 from the origin. Cdc6 association is destabilized by Cdc6 ATP hydrolysis. ATP hydrolysis by ORC completes the Mcm2-7 loading reaction allowing further rounds of Mcm2-7 loading. Mol Cell Volume 21, Issue 2 , 20 January 2006, Pages 143-144 Christin A. Cvetic and Johannes C. Walter Getting a Grip on Licensing: Mechanism of Stable Mcm2-7 Loading onto Replication Origins

15. Fig 17-22 Constitution du pre-replicative complexe (pre-RC) L’origine de réplication est prête à déclencher la réplication

16. Arrive l’activation de S-Cdk Deux actions "contraires" 1 - Déclenchement de la réplication 2 - Blocage de la re-réplication

17. 1 - Déclenchement de la réplication Déclenchement par S-Cdk en fin de G1 Phosphorylation de ORC par S-Cdk et une autre protéine kinase

18. 2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk Par la dissociation de Cdc 6 du ORC (donc plus de pre-RC  plus de réplication) Phosphorylation de Cdc 6  ubiquitinylation par le complexe SCF  dégradation de Cdc 6 dans un protéasome Phosphorylation de protéines Mcm  exportation hors du noyau (intervention de G1/S-Cdk)

19. Fig 17-22 Arrive l’activation de S-Cdk : 1 - Déclenchement de la réplication 2 - Blocage de la re-réplication par S-Cdk

20. S-Cdk • Activité élevée pendant G2 et mitose précoce • Empêche la re-réplication quand S est terminée • Pendant la mitose • M-Cdk • phosphoryle Cdc 6 et les protéines Mcm • donc empêche la re-réplication • En fin de G1 • Aide à l'exportation des Mcm hors du noyau par G1/S-Cdk Inhibition de la re-réplication de l'ADN : intervention des autres Cdk pendant les autres phases du cycle cellulaire

21. Réponse : • A la fin de la mitose, toutes les activités Cdk sont ramenées à zéro  • Déphosphorylation de Cdc 6 et Mcm  • Réassemblage de pre-RC (pre-replicative complexe) Comment se fait la réplication au cycle suivant ?

22. B - Complexe M-Cdk Entrée en mitose

23. Accumulation de M-cycline (= cycline B des vertébrés) • Par diminution de sa dégradation • Par augmentation de la synthèse • Accumulation de M-Cdk (= M-cycline + Cdk 1) • Cdk est soumis à deux régulations (c'est l'inhibition qui l'emporte) • CAK qui phosphoryle et active • Wee 1, protéine kinase qui exerce une phosphorylation inhibitrice à deux sites voisins M-Cdk

24. Accumulation de M-Cdk prêt à agir mais inhibé par la double phosphorylation inhibitrice maintenue par Wee 1 • En fin de G2 activation de Cdc 25 (protéine phosphatase) • Qui retire les deux phosphates inhibiteur de M-Cdk • En même temps l'activité de la kinase inhibitrice Wee1 est supprimée M-Cdk

25. Deux protéine kinases • Kinase Polo • M-Cdk elle-même et M-Cdk phosphoryle et inhibe Wee 1 • M-Cdk • Active son activateur (Cdc 25) • Inhibe son inhibiteur  • Feed back positif  activation de tous les complexes M-Cdk de la cellule  explosion d'activité M-Cdk Qu'est ce qui active Cdc 25 ?

26. Fig 17-23 Activation de M-Cdk • Il y a phosphorylation de M-Cdk en plusieurs endroits : • Sur un site d’activation par CAK • Sur une paire de sites inhibiteur par Wee 1 kinase • L’inhibition l’emporte ( M-Cdk est inactive) polo (Dont la concentration augmente progressivement)

27. Permet d'éviter de faire entrer en mitose des cellules qui n'ont pas répliqué tout l'ADN • Comment ? • Soit détection de l'ADN non répliqué • Soit détection d'une fourche de réplication en activité • Bloque l'activation de M-Cdk (signal négatif) Point de contrôle de la réplication de l'ADN

28. Hydroxyurée : bloque la synthèse de l'ADN  activation d'un point de contrôle  pas d'entrée en mitose (signal négatif) • Caféine à fortes doses : bloque le point de contrôle (signal négatif) • Hydroxyurée + caféine  entrée en mitose malgré un ADN incomplètement répliqué ("mitose suicide") Expériences

29. Fig 17-24 Point de contrôle de la réplication de l'ADN

30. C’est M-Cdk qui fait tout ça ! • A elle seule, elle déclenche tous les processus d'entrée en mitose • Assemblage du fuseau • Attachement des chromosomes au fuseau • Condensation des chromosomes (condensines) (…) • Fragmentation de l'enveloppe nucléaire (lamina nucléaire) • Réarrangement des filaments d'actine • Réorganisation du Golgi • Réorganisation de reticulum endoplasmique • Réorganisation des microtubules • Tout se fait par des phosphorylations de protéines spécifiques de l'événement Rôles de M-Cdk

31. (…) Condensines : complexe de 5 protéines qui condensent le chromosome Phosphorylation par M-Cdk Fig 4-56

32. C - Anaphase Promoting Complexe (APC) Séparation des chromatides sœur à la transition métaphase anaphase

33. A la transition métaphase – anaphase • Déclenchement par M-Cdk puis • complexe Anaphase Promoting Complex (APC) • Perte soudaine de la cohésion entre les chromatides par activation de APC Séparation des chromatides sœur Rappel : les deux plus importantes ubiquitine ligases : • Complexe SCF(Skp1–Cul1–FBP [F box protein]) • APC(anaphase promoting complex)

34. Ubiquitine ligase • Complexe très différent de M-Cdk Anaphase Promoting Complex (APC)

35. Anaphase Promoting Complex (APC) Fig 17-20 B

36. Cohésines (liaison des chromatides sœur) Condensines (condensation des chromosomes) Fig 18-3

37. Fig 17-25 Nécessité de la dégradation des protéines A Inhibiteur d'APC B Ajout de M-cycline non dégradable  la destruction de M-cycline est non indispensable à la séparation des chromatides Indispensable à la sortie de mitose

38. Cible de APC • Avant l'anaphase se lie et inhibe la séparase Sécurine

39. Protéase • Inhibée par la sécurine Séparase

40. Activation de APCpar Cdc 20 (cf infra) • Destruction de la sécurine  • Libération de la séparase • Phosphorylation du complexe cohésine (médiée par polo kinase)  • Clivage du complexe cohésine  • Les chromatides perdent leur cohésine et se séparent Réaction

41. Nécessité de Cdc 20 Déclenchement de l'activation de l'Anaphase Promoting Complex (APC)

42. Fig 17-26 Déclenchement de la séparation des chromatides par APC

43. Synthèse qui augmente à l'approche de la mitose (par augmentation de la transcription) • Phosphorylation de APC Régulation de Cdc 20

44. Quelles kinases phosphorylent et activent le complexe Cdc 20 – APC ? • M-Cdk ? Oui mais phase de latence • Autre ? • Inconnu et pourtant étape clé dans le déclenchement de l'anaphase pendant la phase M Quelles kinases phosphorylent et activent le complexe Cdc 20 – APC ?

45. Vérifie que tous les chromosomes sont attachés correctement au fuseau • Se fait sur le kinétochore • Un kinétochore mal attaché envoie un "signal négatif" qui bloque l'activation de Cdc 20 – APC • Quel "signal négatif" ? Point de contrôle de l'attachement du fuseau

46. Mad2 • Se fixe sur un kinétochore libre • Nécessaire au fonctionnement du point de contrôle • Un seul kinétochore libre entraîne • la liaison de Mad2 et l'inhibition de Cdc 20 – APC • donc l’inhibition de la destruction de sécurine, • donc l’inhibition de l’activation de séparase • donc l’inhibition de la séparation des chromatides etc… Nature du signal négatif

47. Fig 17-27 Prométaphase de cellule de mammifère Fuseau mitotique (vert) Chromatides sœur (bleu) AC anti Mad2 (rouge) sur le kinétochore de la seule chromatide non attachée

48. Mad2 quitte les kinétochores au fur et à mesure que les MT s'y accumulent. On a marqué des cellules mitotiques PtK1 avec des AC dirigés contre Mad2 (orange/rose), contre la tubuline (vert), et l'ADN a été coloré au Hoechst 33342 (bleu).) • Juste après la rupture de l’enveloppe nucléaire. • Flèches blanches, accumulation de Mad2 sur les kinetochores; • pointes de flèches blanches, Mad2 sur des résidus d’enveloppes nucléaires. • Prométaphase précoce. • Green arrowhead, kinetochore fibers are visible as bright dense bundles of green microtubules that end abruptly on a chromosome; • white arrowhead, spindle pole. • Milieu de prometaphase. • White arrowhead, Mad2 on kinetochore microtubules. • Prometaphase tardive. • Métaphase. • Anaphase. • Yellow arrows, newly attached leading kinetochores on congressing chromosomes label brightly for Mad2; • purple arrows, trailing kinetochores on attached kinetochores label less brightly; • green arrows, attached kinetochores that lack Mad2; and • red arrows, attached kinetochores on which some Mad2 is still visible. J. Cell Biol., Volume 141, Number 5, June 1, 1998 1181-1191.Localization of Mad2 to Kinetochores Depends on Microtubule Attachment, Not Tension Jennifer C. Waters, Rey-Huei Chen, Andrew W. Murray, and E.D. Salmon

49. Il n'y en a pas • Si mutation du point de contrôlede l'attachement du fuseau, la chronologie de l'anaphase est normale (ou légèrement retardée chez les mammifères) Point de contrôle de la chronologie de l'anaphase

50. D - M-Cdk Sortie de la mitose Mitosis Exit Network (MEN)