Актуальные вопросы детекции возбудителей заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи

1. Актуальные вопросы детекции возбудителей заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи ФГУН «ЦНИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора Подколзин А.Т., Шипулин Г.А.

2. Особенности лабораторного мониторинга возбудителей заболеваний с фекально-оральным механизмом передачи Восприимчивое звено Факторы передачи Пациент Носитель • Детекция • Типирование

3. Вопросы для обсуждения 1. Детекциябиопатогенов • Выбор технологии • Выбор инструмента 2. Оценка идентичности изолятов • Выбор метода 3. Типичные ошибки

4. Практическая доступность перспективных технологий детекциибиопатогенов Nextgenerationsequencing (высокопроизводительное секвенирование) Масс-спектрометрия (MALDI-TOF MS, IBIS Biosciences) Амплификационныебиочипы (детекциябиопатогенов) Point-of-care (РОС)-тесты (тесты у постели пациента) Иммунологические и неамплификационныебиочипы Классическое секвенирование Real-time PCR

5. Критерии оптимального выбора инструмента • 1. Наличие и адекватный ассортимент доступных диагностикумов • 2. Экономическая целесообразность (стоимость приборов, расходных материалов, диагностикумов, обучения специалистов) • 3. Открытость системы (потенциальная демонополизация поставок расходных материалов и диагностикумов) • 4. Наличие адекватного сервисного обслуживания • 5.Регистрация на территории РФ

6. Сопоставление себестоимости лабораторных методов детекции вирусных агентов ОКИ в РФ (2010г)

7. Соответствие методов выявлении патогенов целям исследований (на примере ротавирусов гр А) Пациенты с манифестной инфекцией Все методы (МАНК, ИФА-АГ, культуральные методы, иммунохроматография) до1012 МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ, иммунохроматография- риск ложнонегативных результатов Пациенты с бессимптомной инфекцией 104 - 106 МАНК, культуральные методы. ИФА-АГ , иммунохроматография- неприменимы Концентрированныеобразцы из окружающей среды 102 - 105 Культуральные методы? МАНК- риск ложнонегативных результатов. ИФА-АГ- неприменимы Продукты питания Минимальная инфицирующая доза

8. Специализированные диагностические тесты для детекции биопатогенов в ООС этап культурального обогащения (проводится в соответствии с требованиями действующих ГОСТ и СП) • Комплекты реагентов для детекции бактериальных патогенов в ООС • Амплисенс Shigella spp EIEC FL • Амплисенс EHEC O157H7 FL • Амплисенс Listeria monocytogenes FL • Амплисенс Salmonella spp FL • Амплисенс Campylobacter spp FL • Амплисенс Cronobacter (E sakazakii) FL

9. Основные требования к прикладным методам генетического типирования биопатогенов • Достаточная разрешающая (дифференцирующая) способность • Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований • - Воспроизводимость (этапов анализа, учета результатов и интерпретации)

10. Основные методы генетического типирования биопатогенов Вирусные агенты Бактериальные агенты Могут использоваться без выделения чистой культуры Мультилокусное секвенирование-типирование (MLST) Требуют выделения чистой культуры - Риботипирование - Электрофорез в пульсирующем поле (PFGE) - Оценка полиморфизма длин фрагментов амплификации (AFLP) - Методики амплификации повторяющихся элементов переменной копийности (MLVA) Секвенирование вариабельных участков генома (отличаются от используемых в диагностических тест-системах)

11. Методы генетического типирования

12. Стабильность маркеров для эпидемиологических исследований Пример из практики Изоляты, выделенные в одном очаге различались по наличию низкомолекулярных плазмид. ! Низкомолекулярные плазмиды являются эпидемиологически нестабильным маркером что отражается в их потере или приобретении бактериальной клеткой из-за влияния факторов окружающей среды в короткий по эпидемиологическим меркам промежуток времени, в т.ч. в период формирования очага групповой заболеваемости или изоляции культур.

13. Типовые казусы (к вопросу о здравом смысле)

14. Примеры нецелевого использования диагностических инструментов зима 2010 – поиск ротавирусов в снегу (как потенциального источника поступления ротавирусов в реку, из которой проводится водозабор) РФ 2010 – плановое тестирование молочной продукции на содержание ротавирусов в период сезонного подъема заболеваемости РФ 2010 – применение ИФА-АГ для выявления ротавирусов в воде

15. Примеры нецелевого использования диагностических инструментов Псевдотипирование Применение методов амплификации со случайными праймерами (RAPD – ПЦР)- внутрилабораторный уровень невоспроизводимости Нецелевое секвенирование Попытки установить серотиповую принадлежность энтеровирусов (определяемую геном капсида – VP1) на основе секвенирования 5’ UTR (мишень в диагностических тест-системах)

16. В качестве заключения… Лабораторные методы детекции биопатогенов в факторах передачи – важный, но ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЙ инструмент в руках эпидемиолога. Принципы доказательной медицины успешно реализуются при использовании косвенных - статистических методов анализа эпидемиологических данных, доказывающих роль факторов передачи в развитии заболеваемости.

17. Благодарю за внимание! Контактная информация: «Референс-центр по мониторингу возбудителей острых кишечных инфекций» 111123, Россия, г.Москва, ул. Новогиреевская, 3а +7(495) 974 96 46.