分光光度计

1. 分光光度计 南京师范大学 生命科学学院

2. 1、分光光度计的原理 • 分光光度计是根据物质对光的选择性吸收来测量微量物质浓度的仪器，具有灵敏度、准确度高，操作方便、快速等特点。其工作原理为光的吸收定律（朗伯—比尔定律）：一束单色光(强度为I0)通过某吸光物质的溶液时，其光能量的被吸收与该物质浓度的关系符合朗伯—比尔定律，即当入射光波长、温度和溶液的厚度一定时，吸光度与溶液的浓度成正比。

3. 用公式表示为： • T = I／I0 • 则 A = lg（1／T） =Kbc • 式中 T — 透光率 • I — 透过光强度 • I0 — 入射光强度 • A — 吸光度 • K — 比例常数 • b — 溶液的厚度 • c — 溶液的浓度

4. 2、植物学实验室常用类型 （一）722型分光光度计 722型分光光度计能在近紫外、可见光谱区域内对样品物质作定性和定量的分析。其色散元件为衍射光栅，波长精度比721好，且数字显示读数。

5. 722型分光光度计 1.数字显示器；2.吸光度调零旋钮；3.选择开关；4.吸光度调斜率电位器；5.浓度旋钮；6.光源室；7.电源开关；8.波长手轮；9.波长刻度窗；10.试样架拉手；11.100%T旋钮；12. 0%T旋钮；13.灵敏度调节旋钮；14.干燥器

6. 1. 使用方法 （1）将灵敏度旋钮调整“1”档（放大倍率最小）。 （2）开启电源，指示灯亮，仪器预热20分钟，选择开关置于“T”。 （3）打开试样室盖（光门自动关闭），调节“0%T”旋钮，使数字显示为“00.0”。 （4）将装有溶液的比色皿放置比色架中。 （5）旋动仪器波长手轮，把测试所需的波长调节至刻度线处。

7. (6) 盖上样品室盖，将参比溶液比色皿置于光路，调节透过率“100%T”旋钮，使数字显示为“100.0T”（如果显示不到100%T，则可适当增加灵敏度的档数，同时应重复“3”，调整仪器的“00.0”） （7）将被测溶液置于光路中，数字表上直接读出被测溶液的透过率（T）值。 （8）吸光度A的测量，参照“3”“6”调整仪器的“00.0”和“100.0”，将选择开关置于A 旋动吸光度调零旋钮，使得数字显示为.000，然后移入被测溶液，显示值即为试样的吸光度A值。（9）浓度C的测量，选择开关由A旋至C，将已标定浓度的溶液移入光路，调节浓度按钮，使得数字显示为标定值，将被测溶液移入光路，即可读出相应的浓度。

8. 2. 注意事项 主要要注意以下几点： （1）在接通电源之前，应该对于仪器的安全性进行检查，电源线接线应牢固，通地要良好，各个调节旋钮的起始位置应该正确。 （2）电表的指针必须位于零刻线上。若指针偏离，则可用电表上的校正螺丝进行调节。 （3）仪器底部放有 2 只干燥剂筒，用以保持仪器的干燥，此外在仪器停止工作期间，在比色皿暗箱内，塑料仪器套内都应放防潮硅胶袋。 （4）仪器的连续使用时间不应超过 2 h。使用后必须间歇0.5h，才能再用。 （5）务必保持比色皿透光面的清洁。不要用手摸比色皿的光滑的表面，更不要用毛刷刷洗比色皿，以免影响读数的准确。

9. （6）脏的比色皿可浸泡在肥皂水中，然后再用自来水和蒸馏水冲洗干净。倒置晾干备用。 （7）每台仪器所配套的比色皿不能与其它仪器上的比色皿单个调换。 （8）如果大幅度改变测试波长时，需等数分钟后才能正常工作（因波长由长波向短波或短波向长波移动时，光能量变化急剧，光电管受光后响应较慢，需一段光响应平衡时间）。

10. （二）751G 型分光光度计 • 可测定各种物质在紫外区可见光和近红外区的吸收光谱，供实验室进行各种物质的定性及定量的分析。

11. 1. 使用方法 包括以下几点： （1）检查电源电压是否与仪器所要求的电压相符，然后再插上电源插头。 （2）根据测定所要求的波长选择光源灯。在波长 320 ～ 1 000nm 范围内用钨灯作为光源。在波长 200 ～ 320nm 范围内，用氢弧灯作为光源。拨动光源选择杆使所需要的光源灯进入光路。根据需要可以把滤光片推入光路，以减少杂散光，但通常情况下没有这种必要。把波长刻度旋到所要的波长上。 （3）检查仪器的各种开关和旋钮使之处于关闭位置。然后再打开电源开关，使仪器预热 20 min。

12. （4）选择适当波长的光电管。如测定的波长在 200 ～ 625 nm 范围内，用紫敏光电管，此时应将手柄推入。如测定的波长在 625 ～ 1 000 nm 范围，用红敏光电管，应将手柄拉出。 （5）根据波长选择比色皿。测定的波长在 350 nm 以上时，用玻璃比色皿。测定波长在 350 nm 以下时，则需用石英比色皿。在比色皿中装好溶液，放在暗箱内的托架上，然后把暗箱盖好。

13. （6）把选择开关拨到“校正”位置上。调节暗电流使电表指针指到“ 0 ”。为了得到较高的准确度，每测量一次都应校正一次暗电流。 （7）在一般情况下，旋转灵敏度旋钮从左边停止位置顺时针转动三圈左右。 （8）旋转读数钮，使刻度盘位于透光率 100 ％位置上。把选择开关拨到“× 1 ”处，然后拉开暗电流闸门，使单色光进入光电管。 （9）调节狭缝，使电表指针接近零位。尔后再用灵敏度旋钮细致调节，使电表指针正确地指在“ 0 ”上。

14. （10）把比色皿定位装置的拉杆轻轻地拉出一格（注意应使滑板处在定位槽中），使试样溶液进入光路，这时电表指针偏离零位。 （11） 转动读数电位器旋钮，重新使电表指针移到“ 0 ”位上，此时刻度盘上的读数即为试样的透光率和相应的光吸收值。 （12） 取得读数后，应即时将暗电流闸门重新关上，以保护光电管，防止受光时间过长而疲劳。

15. （13） 在读取透光率和相应消光值的数值时，若选择开关在“× 1 ”处，透光率范围为 0 ％～ 100 ％，相应消光值范围由∞～0 。当透光率小于 10 ％时，则可把选择开关拨到“× 0.1 ”位置，此时所读取的透光率数值，应以 10 除之。而所读出的消光值应加上 1.0 。 （14） 需要用同一标准溶液测定几个样品时，可重复以上的操作。 （15） 测定完后，应把各个旋钮和开关复原或关闭，拔下插销，并把仪器罩好。

16. （三）754型荧光分光光度计 • 一种可供在紫外到红外区(200-1000nm)测量吸收光谱的较高级分光光度计。此仪器的光学部分与721型分光光度计相类似，但它采用石英棱镜作单色光器，有钨丝灯和氢弧灯两种光源.754型分光光度计的电学部分较为复杂。光电流经过放大线路加以放大后,此时得到的样品信号变为与透光率成比例的值。其后，调零，变换对数，浓度计算，打印数据等均由微处理机进行。

17. 1. 使用方法： （1）打开电源开关之前,检查一下试样室是否放置遮光物。 （2）试样槽置“参考”位置。 （3）接电源开关（如果波长工作在200～360 nm时需按氘灯触发按钮）。 显示器显示"754"后，数显：“100.0”，则表示仪器已通过自检程序。

18. （4）仪器预热30 min后开始测试。 （5）数显为100.0后，稳定2～3s，即可把试样槽置“样品”位置进行测试。待第一个数据打印完毕后，再将试样槽置第二个“样品”位置测试。 （1）每当需要调换波长时，必须把试样槽置“参考”位置，重新调满度。