VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS

1. 9. lekcija VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA PROTOPLASTU KULTŪRAS

2. 9. lekcija 9.1. VIENAS ŠŪNAS KULTŪRA 9.1. Vienas šūnas kultūras teorētiskā jēga Atsevišķa somatiskā šūna kalpo kā modelis, lai pētītu • šūnas un apkārtējās vides savstarpējās attiecības,   • attiecības ar saimniekaugu, • ar dažādiem patogēniem aģentiem; • lai pētītu šūnas uzbūvi, • diferenciāciju un • dediferenciāciju, • bioķīmiju, • augstāko augu ģenētiku, u.c.

3. 9. lekcija Vienas šūnas klonu iegūšana sastāv no 2 etapiem: dzīvotspējīgas vienas atsevišķas šūnas izolēšana, apstākļu kompleksa nodrošināšana šīs šūnas normālai attīstībai un dalīšanās procesam.

4. 9. lekcija Metodes šūnas izolēšanai: kallusa iegūšana ar sekojošu suspensiju kultūru radīšanu, kas sastāv no atsevišķām šūnām un nelieliem to agregātiem, atsevišķo šūnu izolēšana tieši no veselu augu audiem.Kā iegūt atsevišķas šūnas no kallusa, aprakstīts, iegūstot suspensiju kultūru.

5. 9. lekcija Pirmais mēģinājums iegūt vienas šūnas audzēšanu sterilos apstākļos, veikts 1902.g. (Haberlandt). Toreiz tika izmantoti 3 dažādi augi, bet šūnas izdzīvoja tikai 15 dienas Knopa barotnē ar 1-5% saharozi, mazliet palielināja izmērus, bet nedalījās. Vēlākajos mēģinājumos zinātnieki uzlaboja barotnes sastāvu. 1959.g. Kohlenbach mēģināja audzēt Macleya cordata mezofila šūnas White barotnē, papildus pievienojot 2,4-D un kokosriekstu pieniņu.

6. 9. lekcija Ball un Joshe (1963, 1965) konstruēja speciālu kameru šiem mērķiem. Viņu eksperimentu objekts – Arachis hypogaea dīgļlapju mezofila šūnas. Šai kamerā autori novēroja citoplazmas kustības, šūnas tilpuma palielināšanos. Pēc 14 dienām no vienas šūnas ieguva 30 šūnas. Hloroplasti tajās zaudēja zaļo krāsu, bet palielināja izmērus. Līdzīgus rezultātus šie zinātnieki ieguva ar Aster, Erogeron, Gaillardia un Oenothera lapu šūnām.

7. 9. lekcija Lai audzētu vienu šūnu in vitro, ir vairākas metodes, ko varētu iedalīt 3 grupās:kultūras-“aukles”metode,mikrokultūrasmetode,pleitingametode – kultivēšana Petri platītēs uz agarizētas barotnes.

8. 9. lekcija •  Kultūras-“aukles” metode • Atsevišķas šūnas, kas izolētas ar adatu, cilpu vai mikropipeti no kallusa vai suspensiju kultūras, tiek pārvietotas uz sterila filtrpapīra kvadrātiņiem (apmēram 8x8 mm). • 2-3 dienas pirms šūnu izolēšanas filtrus aseptiski novieto virs kallusa-“aukles” audiem, no kuriem izolēs šūnu (vai no līdzīga kallusa). Šāda pirmsapstrāde nepieciešama, lai filtrs samitrinātos un tajā absorbētos barības vielas no “mātes” kultūras.

9. 9. lekcija Pēc šūnas izolēšanas to novieto uz filtrpapīra un to savukārt virs kallusa audiem atpakaļ. To veic ļoti ātri, lai šūna nežūtu. Šī izolētā šūna nekontaktē ar kallusa šūnām, un tomēr difūzijas ceļā caur filtra barjeru saņem no tām barības vielas un faktorus, kas inducē šūnu dalīšanos. Kallusam-“auklei” novecojot, filtru ar šūnu vai šūnu kolonijām pārvieto uz jaunu kallusu. Jebkurā laikā šo filtru var palikt zem mikroskopa un pārbaudīt šūnu dzīvotspēju. Ap 8% šūnu, ko ieguva šādā veidā, dalījās.

10. 9. lekcija Kolonijas, kas sasniegušas 4 mm diametru, pārnes uz agarizētu barotni. Atkarībā no augšanas tempiem, pēc 2-4 nedēļām koloniju sadala un pārnes uz jaunu barotni kā vienas šūnas klonu. Viena no pirmajām kultūrām, ko šādā veidā pavairoja, bija saulespuķe Helianthus annuus; tā auga gan uz saulespuķes, gan uz margrietiņas kallusa. Margrietiņas vienas šūnas kultūra auga tikai uz sava kallusa – 11,5 mēnešus jeb 11 pasāžas, pēc tam to pārnesa uz agarizētu barotni.

11. 9. lekcija Literatūrā aprakstīti labi rezultāti, ja filtrpapīra gabaliņus ar izolēto šūnu novietoja uz agarizētas (0,6%) barotnes, kas saturēja rauga ekstraktu, apkārt kallusa audiem vai arī otrādi – ja kallusa audi bija apkārt. Tas varētu būt tāpēc, ka jaunākās un dzīvākās kallusa šūnas veidojas tieši malās.Ar šo metodi iegūtas daudzu taksonu vienas šūnas kultūras, bet plašu pielietojumu tā nav iemantojusi.

12. 9. lekcija Mikrokultūras metode Šīs metodes priekšrocība ir iespēja veikt ilgstošus novērojumus zem mikroskopa, kā šūna aug un attīstās. Šī metode atļauj arī mikrokultūras filmēšanu. Uzsākot kultūru, šūnu suspensiju atšķaida Petri platītē, un no tās ar sterilu mikropipeti uzsūc šķīduma pilieniņu ar vienu šūnu. Tad to ievieto speciālā kamerā vienā pilienā barības šķīduma, kam apkārt ir minerāleļļa. Darbību veic zem mikroskopa.

13. 9. lekcija Līdz 80.-iem gadiem bija konstruētas 4 dažāda tipa mikrokameras. Šīs kameras atšķiras pēc šķīduma novietojuma: 1)-karājošā piliena princips, 2) – sēdošā piliena, 3) kamera ir no speciāla stikla ar plānām sieniņām, kas sevišķi izdevīgi pastāvīgiem novērojumiem zem mikroskopa un 4) – perfūzās kameras. Pēdējām ir divas atveres, kas noslēgtas ar priekšmetstikliņiem; tas dod iespēju periodiski mainīt barības šķīdumu.

14. 9. lekcija

15. 9. lekcija 1. Izsēšanas metodeSuspensiju kultūru, kas sastāv no atsevišķām šūnām, sajauc ar 35-40º C agarizētu barotni, kas šajā temperatūrā ir šķidrā veidā un izlej Petri platītēs 1 mm plānā slānī.Lai novērstu barotnes izžūšanu un inficēšanos, platītes aizlīmē ar tam paredzēto līmlentu. Suspensijas iegūšanai no atsevišķām šūnām izmanto divkāršo suspensiju filtrēšanu aseptiskos apstākļos ar atšķirīgu filtru poru diametru. Eksistē arī savādākas izsēšanas metodes.

16. 9. lekcija 2. Plāksnītes-kopijasmetodeTā pamatojas uz šūnu augšanu caur sietiņu. Pirmo reizi šī metode tika lietota mikroorganismu replikācijai (Lederberg, Lederberg, 1952), bet augu šūnu kultūrai to pirmo reizi modificēja Schulte un Zenk (1977) objektam Morinda citrifolia.

17. 9. lekcija Standarta barotnei pievienoja 60% barotnes ar 8-dienu vecu Morinda citrifolia kultūru. Izsēšanas blīvums bija 3600 šūnu/ml. Lai replikācija būtu veiksmīga, izsējas blīvumam jābūt minimāli 1500 šūnu/ml.

18. 9. lekcija Kad šūnas šādā veidā bija augušas 14 dienas, Petri platītē (tās diametrs – 8,3 cm) ievietoja sterilu neilona sietiņu (8,1 cm diametrā, 15-20 pavedieni uz 1 cm2) tā, lai tas būtu ciešā kontaktā ar agarizēto barotni un neveidotu krokas. Pēc 20 dienām sietu noņēma un pārvietoja citā Petri platītē ar jaunu agarizētu barotni, uzliekot otrādi – ar augšpusi uz leju. Tādā veidā šūnas no plāksnītes-saimnieka pārnes uz plāksnīti-kopiju.

19. 9. lekcija Sekmīgas replikācijas nodrošināšanai liela nozīme ir sieta īpašībām: atvēruma izmēriem; siets nedrīkst locīties, tam jābūt arī pietiekoši smagam, lai kontaktētos ar barotnes virsmu, tam jāiztur 60 min. autoklāvēšana 120º C režīmā, jābūt ķīmiski inertam, sieta šķiedras nedrīkst uzsūkt barības vielas, un  kopumā tas nedrīkst ietekmēt šūnu dzīvotspēju.Sieta caurlaidību izvēlas atkarībā no kultivējamo šūnu izmēriem.

20. 9. lekcija Metode piemērojama, lai atlasītu šūnas un kolonijas, kas iegūtas no protoplastiem,  mutantiem, kā arī tādu šūnu atlasei, kas pastiprināti sintezē sekundāros metabolītus.

21. 9. lekcija Izsēšanas efektivitātes paaugstināšanaIzmantojot izsēšanas metodi uz agarizētas barotnes, var veidoties situācija, ka kloni var attīstīties no dažādām šūnām. Tas nozīmē, ka liela nozīme ir filtrēšanas precizitātei.

22. 9. lekcija Pētot atšķirības starp vienas šūnas kloniem, kas iegūti no Haplopappus gracilis un Daucus carota ar izsēšanas metodi, konstatēja, ka, lietojot burkānu suspensijas filtrēšanai marli, ieguva 80% vienādu šūnu, bet lietojot zīda audumu – 90%; Haplopappus gracilis attiecīgi – 25% un 30%.

23. 9. lekcija Šūnu kolonijas nedrīkst sastāvēt vairāk kā no 2-4 šūnām. Šīs šūnas dalās un attīstās ātrāk nekā atsevišķās šūnas, kas apgrūtina darbu. Un, protams, kā visos darbos ar audu kultūrām, ļoti būtiska nozīme ir barotnes sastāvam, kas katrā atsevišķā gadījumā būs savādāks. Viena un tā paša auga, to pašu šūnu kultivēšanas barotnes atšķirsies pat tādā gadījumā, ja nebūs vienāds izsēšanas blīvums:jo blīvāka suspensija tiek izsēta, jo barotnei var būt vienkāršāka receptūra, un otrādi – jo izsējas blīvums būs mazāks, jo pieaugs nepieciešamība pēc sarežģītākas barotnes sastāva.

24. 9. lekcija Koblitz barotne šūnu kultūrām(sastāvs tuvināts kokosriekstu pieniņam), devas tabulā dotas mg.L-1

25. 9. lekcija Ar atsevišķiem objektiem izpētīts, ka kultivēšanas efektivitāti var palielināt, paaugstinot CO2 koncentrāciju atmosfērā kultivējamā kamerā, kur novietotas Petri platītes, līdz 1%.Atmosfēras sastāvu šai kamerā iespējams regulēt un kontrolēt. Tas veicina ne tikai izsēšanas efektivitātes paaugstināšanu (atsevišķos eksperimentos sēšanas blīvums 500 šūnu/ml bija pietiekams), bet arī samazina rezultātu variabilitāti, kas šādos pētījumos mēdz būt diezgan liela.

26. 9. lekcija Piemērskartupeļu šūnu kultivēšanai(Birgit Berndt) Šķidrā barotne ar šūnām, slāņa biezums 1 mm Agarizēta barotne   

27. 9. lekcija 9.1.2. Vienas šūnas klonu selekcijaŠūnu izsēšana uz agarizētas barotnes ir būtiska metode vienas šūnas klonu fizioloģiskiem un ģenētiskiem pētījumiem.

28. 9. lekcija Uz Petri platītes ar ~ 1 mm agarizētas barotnes slāņa uzsētas šūnas, no kurām veidojas šūnu kolonijas,kalluss Iespējama apstrāde ar ķīmiskiem reaģentiem un 1 šūnas klona atlase selekcija

29. 9. lekcija Šo klonu izolācija parādīja kallusu un suspensiju kultūru heterogenitāti. Vienas šūnas kloni atšķiras pēc auguma, struktūras, krāsas, spējām izmantot barotnes komponenetus, pēc diferenciācijas, organoģenēzes potencēm, kā arī pēc dažādu savienojumu biosintēzes spējām. Šīs šūnas var atšķirties arī ar ploiditāti. Piemēram, bija iegūti atšķirīgi Atropa beladonna kloni, respektīvi, kam bija dažāds augšanas ātrums, prasība pēc barības elementiem; kas atšķīrās pēc hloroplastu struktūras un daudzuma, u.c.

30. 9. lekcija Lai atlasītu klonus, var veikt iepriekšēju suspensijas apstrādi ar mutagēnām vielām, antimetabolītiem, paaugstinātām sāļu devām, dažādiem fiziskiem faktoriem, kā radiācija, paaugstināta vai pazemināta temperatūra,  atšķirīgs gaismas spektrālais sastāvs un intensitāte.

31. 9. lekcija Šūnu kultūrās var rasties kloni ar vēlamām īpašībām, un šos klonus iespējams atlasīt un pavairot, veidojot izturīgu šūnu līnijas. Piemēram, Eriksson jau 1967.g. tādā veidā ieguva Haplopappus gracilis ar augstu antociānu saturu apstrādē ar ultravioleto starojumu. Carlson (1973) izdalīja tabakas šūnas, kas ir izturīgas pret metionīn-sulfoksamīdu un ieguva reģenerantus, kas savukārt ir izturīgas pret patogēnu Pseudomonas tabaci. Iegūti vienas šūnas tabakas kloni, kam piemīt dažāda izturība pret vīrusu vairošanos šūnā.

32. 9. lekcija Rezumējot izklāstu, kallusa kultūru, suspensiju un vienas šūnas kultūru pielietojums kalpo noteiktu īpašību pastiprināšanai un vienas šūnas klonu atlasei ar šīm īpašībām, respektīvi,selekcijai in vitro. Gala rezultāts nav tikai teorētisks, tam ir liela komerciāla nozīme.

33. 9. lekcija 9.2. PROTOPLASTU KULTŪRASProtoplasts ir šūna (precīzāk – šūnas daļa) bez šūnapvalka.Lai veidotu protoplastu kultūras, no šūnapvalka atbrīvojas fermentatīvā ceļā.

34. 9. lekcija Protoplastu kultūru metode ir viena no visperspektīvākām metodēm ģenētikā, fizioloģijā, virusoloģijā un molekulārā bioloģijā.Pateicoties protoplastu spējai ieņemt sevī makromolekulas un organellas, iespējai protoplastus sapludināt un sekojoši inducēt meristematisko aktivitāti, bet gala rezultātā iegūt veselu reģenerantu, - šī metode ideāli noder augu šūnas modifkācijai un gēnu inženierijai.

35. 9. lekcija Lai risinātu ģenētikas jautājumus, protoplastu kultūras lieto:somatisko hibrīdu iegūšanai no attāli radniecīgiem vecākiem, kas krustojot nedod dzīvotspējīgus pēcnācējus,jaunas augu daudzveidības iegūšanai transgenozā ceļā, ievadot protoplastā svešu gēnu vai tā daļu,neuzņēmības radīšanai pret dažādām slimībām, ievadot protoplastā to genoma daļu, kas atbild par izturību pret vienu vai otru patogēnu, u.c.

36. 9. lekcija Tā kā protoplastiem nav apvalka, tajos vieglāk iekļūst fizioloģiski aktīvās vielas, un mums rodas iespēja novērot primāro augu šūnas reakciju uz tām. Lieto arī savienojumus ar iezīmētiem atomiem, kas ļaujpētīt tometabolismukontrolējamos apstākļos. No protoplastiem iespējams izdalīt dzīvus un normālifunkcionējošusorganoīdusbioķīmiskiem un fizioloģiskiem eksperimentiem.Tā kā protoplastiem šunapvalks atjaunojas nosacīti īsā laikā, tad ir ērti izsekot, kā veidojascelulozes fibrillas.

37. 9. lekcija Tomēr nevar teikt, ka protoplasts pēc savām īpašībām ir identisks šūnai, tikai bez apvalka. Lai kultivētu protoplastus, bieži ir vajadzīgi citi apstākļi un fizioloģiski aktīvās vielas nekā kultivējot atbilstošo šūnu kultūru.Ir izteikta hipotēze, ka, izolējot protoplastus, tiek zaudēta arī daļa plazmolemmas (Prevot, 1977). Tādējādi var tikt zaudēta arī daļa aktīvo komponentu, piemēram, inhibitoru. Tas acīmredzot traucē normālu diferenciāciju.

38. 9. lekcija Protoplastus var iegūt no dažādu audu šūnām. Iegūšanas metodes bija divas – mehāniskā un fermentatīvā.Lietojot mehānisko metodi, vispirms izraisīja plazmolīzi un pēc tam izgrieza šūnu. Šī metode bija ļoti darbietilpīga un mazefektīva, tādēļ tā tika maz lietota. Fermentatīvo metodi pirmo reizi pielietoja Cocking (1966).

39. 9. lekcija Šūnapvalka sadalīšanai lieto vienu vai vairākus fermentus, kā celulāzi un pektināzi, to preparātus. Populārākie celulāzes preparāti ir “Onozuka” P-3000, P-1500, R-10, “Meicelase P”, driselāze; pektināzes preparāti – “Macerosyme R-10”, “Pectinase”, “Pectinol R-10”.

40. 9. lekcija Fermentus pirms lietošanas sterilizē filtrējot vai nu ar Millipore (poru diametrs 0,45 m) vai ar stikla filtru 3G5. Fermentu veidu, sastāvu un koncentrāciju piemeklē empīriskos eksperimentos katrai augu dažādībai un audu veidam atsevišķi. Piemēram, lai izdalītu protoplastus no lapām, saknēm un veidotājaudiem, varētu lietot “Onozuka R-10” un “Macerozyme R-10” maisījumu, katru 0,1-0,2% koncentrācijā, bet lai izdalītu protoplastus no ziedlapiņām un augu šūnu kultūrām – “Driselase” 0,5-5% koncentrācijā.

41. 9. lekcija Protoplastu izdalīšanaProtoplastus var izdalīt kā no in vitro, tā no in vivo augiem. Piemēram, in vivo augoša auga lapu serilizē, atdala epidermu un novieto tādā pašā stāvoklī mazā Petri platītē ar plānām sieniņām, lai būtu ērta novērošana caur binokulāro stereoskopisko mikroskopu.

42. 9. lekcija Platītē ir barības šķīdums, kam pievienots osmolītiķis un vajadzīgie fermenti. Kā barības vielu, tai skaitā cukuru, kvalitatīvo un kvantitatīvo saturu, tā arīnepieciešamos fermentus, to koncentrāciju un ekspozīcijas laiku, nosaka empīriskos izmēģinājumos katram taksonam, tā orgānam un audu veidam atsevišķi.

43. 9. lekcija Piemērs barotnei protoplastu izdalīšanai(ekspozīcija 17 h tumsā,autori E.Firoozabady, D.L.DeBoer, obj. Gossypium hirsutum un G. Barbadense 3 ned. vecu augu jaunās lapas)

44. 9. lekcija Ja fermentus pievieno lielākā koncentrācijā, protoplastu izdalīšanās ir ātrāka, bet var tikt bojāta citoplazma. Ja nav speciāla nepieciešamība pēc gaismas, tad Petri platītes ievieto siltumā un tumsā, kas samazina šūnu un protoplastu stresu, un līdz ar to arī palielina to izdzīvotību.

45. 9. lekcija Kad izdalījušos protoplastu daudzums ir pietiekams (zem mikroskopa var veikt arī skaitīšanu), tos kopā ar šķīdumu “atmazgā” no fermentiem. Vispirms suspensiju nolej un filtrē caur sietu, lai atbrīvotos no nevajadzīgām auga daļām, tad centrifugē. To veic vairākas reizes, noņemot vajadzīgo frakciju un tai pievienojot svaigu barības šķīdumu ar kādu no cukuriem vai to maisījumu osmolītiskā koncentrācijā. Tas nepieciešams, lai protoplasts saglabātu apaļo formu, lai tas neizjuktu. Centrifugēšanai jānotiek ļoti maigā režīmā, kā, piemēram, 100 g 1 minūtē (literatūras dati).

46. 9. lekcija Apskatīsim vienu piemēru.Sterilu krizantēmu lapu ar asu skalpeli sagraiza, kā parādīts zīmējumā, un novieto Petri platītē ar iegriezto pusi uz šķīduma virsmas.

47. 9. lekcija Šeit ir arī neliels “āķis”: no tādām lapām, kas nepeld pa šķīduma virspusi, bet atrodas šķīdumā, protoplasti neizdalās. Konkrētajā gadījumā bija vajadzīgs šāds šķīduma sastāvs:  1% “Onozuka R-10”, 0,4% dreiselāze,  0,5 mol.L-1 saharoze,  5 mmol.L-1 CaCl2.

48. 9. lekcija Kultūru ievieto tumšā kamerā.Pēc 3 stundām ar Pastēra pipeti ņem šķīdumu un laiž cauri 2 sietiem (kaprona sietus sterilizē autoklāvējot tādā režīmā kā barotnes absolūti plakanā gludā veidā).Vispirms ņem sietu, kam poru diametrs 1000 µ, tad otru - ar poru diametru 100 µ. Beigās pāris pilienu liek uz priekšmetstikliņa un skatās invertētā mikroskopā.

49. 9. lekcija Centrifugēšana: Pirmā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze,centrifugēšana 1000 apgr./1 min.Otrā un trešā reize: 0,5 mol.L-1 saharoze + MS barotne ar modifikācijām, centrifugēšana 700 apgr./3 min.Dotais variants bija labākais no izmēģinātajiem, kaut gan tas atšķiras no klasiskajiem (piemēram, ar centrifugēšana) (piemērs par krizantēmām ņemts no G.Jakobsones izmēģinājumiem 1986.g. Maskavā).

50. 9. lekcija Protoplastu kultivēšanaPēc tam protoplastus izsēj Petri platītēs, parasti šķidrā barotnē, lai tos mazāk bojātu. Dzīvu protoplastu stāvoklis nevar saglabāties ilgi – ja tie izdzīvo, tie veido šūnapvalku un dalās. Tādēļ šis ir brīdis, lai veiktu dažādas manipulācijas ar protoplastiem.