AGROBIOTECNOLOGÍA

1. AGROBIOTECNOLOGÍA Biotecnología Vegetal Ma. Mercedes Rivero Instituto de Ingeniería Genética y Biología Molecular (INGEBI) Programa de Biotecnología para América Latina y el Caribe Universidad de las Naciones Unidas http://www.unesco.org/unuoe/unuesp/centros/biolac.htm

2. Biotecnología Vegetal • Cultivo in vitro de células, tejidos y órganos • micropropagación • mejoramiento de plantas • producción de compuestos de interés comercial producción de metabolitos secundarios producción de proteínas producción de polímeros biodegradables • establecimiento de plantas transgénicas plantas resistentes a virus plantas con rutas metabólicas modificadas plantas mejoradas en cuanto a composición de proteínas, aceites, etc. • fitorremediación remoción de xenobióticos remoción de metales pesados

3. Micropropagación vegetal Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas Vías morfogenéticas:organogénesis y embriogénesis Agrobiotecnología Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de tejidos vegetales Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores Alcances de la propagación clonal masiva de plantas Referencias Sumario

4. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales

5. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Principales conceptos fisiológicos aplicables a los cultivos in vitro • Existen tres conceptos básicos que fundamentan el cultivo in vitro de células y tejidos vegetales: • - Totipotencialidad celular • - Desdiferenciación / Rediferenciación • - Balance de reguladores del crecimiento • vegetal

6. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Fundamentos teóricos y prácticos del cultivo de tejidos vegetales • La teoría de la totipotencialidad celular, enunciada • por Haberlandt a principios del siglo veinte, postula que toda célula vegetal individual es capaz de regenerar una planta entera a partir de un cultivo in vitro sin importar el grado de diferenciación alcanzado. Para ello se requieren condiciones específicas referidas al medio del cultivo, relaciones hormonales, temperatura, fotoperíodo, etc. • La desdiferenciación consiste en la transformación y pérdida de las características de especialización de un tipo celular para dar lugar a células de tipo meristemático. El siguiente paso involucrado en la regeneración de una planta es la rediferenciaciónde las células previamente desdiferenciadas. • Todo proceso de diferenciación está regulado por el balance entre diferentes tipos dereguladores del crecimiento, fundamentalmentedeauxinas y citocininas.

7. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Técnicas del cultivo de células y tejidos vegetales • Micropropagación vegetal • Regeneración de plantas • (embriogénesis y organogénesis) • Cultivo de meristemos • Cultivo de suspensiones de células vegetales • Cultivo de protoplastos • Cultivo de anteras • Cultivo de óvulos y embriones

8. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Micropropagación vegetal

9. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales La micropropagación constituye la principal aplicación comercial del cultivo de tejidos vegetales • La micropropagación vegetal, o propagación clonal masiva de plantas superiores, posibilita la obtención • y cultivo de plantas a gran escala. • Se realiza bajo estrictas condiciones de esterilidad en un medio sintético nutritivo y con control de temperatura, luz y fotoperíodo.

10. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Consideraciones técnicas de la propagación clonal masiva de plantas

11. Laboratorio - Area de preparación de medios. - Area de lavado y esterilización. - Cuarto estéril. - Cámara de cultivo. - Area de rusticación. • Material vegetal - Plantas madres seleccionadas (pre-acondicionamiento). - Explantes (elección, disección, esterilización, etc.). • Condiciones de cultivo - Asepsia. - Recipientes. - Temperatura. - Luz y fotoperíodo. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales La micropropagación vegetal requiere disponer de una infraestructura mínima especializada y de condiciones controladas de cultivo

12. Medios de cultivo: composición general Compuestos inorgánicos Macronutrientes: NO3-, PO43- , K+, Ca2+, Mg2+, SO42- Micronutrientes: Fe2+, Cu2+, Zn+, Mn2+, Mo2+, Co2+, I- Carbohidratos Sacarosa, glucosa, mio-inositol Vitaminas Tiamina (B1) Piridoxina Acido nicotínico (C) Biotina Aminoácidos Glicina Reguladores del crecimiento Auxinas Citocininas Giberelinas Soporte inerte (medios semisólidos) Agar (0,7 a 1%) Gelrite® pH 5,6 – 5,8 Esterilización 1 atmósfera, 15 a 20 minutos en autoclave

13. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Formulación básica de un medio de cultivo para tejidos vegetales • Soluciones concentradas de macroelementos (100x) • Soluciones concentradas de microelementos (100x) • Vitaminas grupo B (500 ó 1000x) • Mio-inositol (100 mg/L) • Azúcares: Generalmente sacarosa o glucosa • en concentraciones de aproximadamente 30 g/L. • Agar-agar: hidrato de carbono de alto peso • molecular extraído a partir de algas. Se usa entre • 5 y 10 g/L

14. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Propiedades físicas de los medios de cultivo Semisólido Consistencia del medio Líquido • El metabolismo de los tejidos puede modificarse • dependiendo de las características del medio de cultivo • (líquido o semi-sólido). • En el caso de un medio sólido, la concentración y calidad • del agar pueden tener importantes efectos en el desarrollo • del cultivo (hiperhidricidad, crecimiento lento, etc.). • El cultivo en medio líquido resulta imprescindible cuando • la propagación invitro es desarrollada a través • de las siguientes vías: • - Inducción de embriogénesis*. • - Cultivo de protoplastos. • Cultivo de suspensiones celulares. • *también en medio semisólido

15. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Intercambio gaseoso: • Los recipientes de cultivo se tapan con una película de polietieleno (Resinite) para posibilitar el intercambio de gases. La organogénesis puede verse modificada si el intercambio de gases se ve dificultado. • - La inducción de yemas a partir de callos • de tabaco se reduce si no hay suficiente oxígeno. • - La acumulación de etileno puede inhibir • la regeneración de brotes. • pH: • - Constituye un factor crítico. • - Se ajusta en el rango 5,5 – 5,8. • - Se modifica durante el crecimiento de los cultivos. Propiedades físicas de los medios de cultivo

16. Composición de medios de cultivo comúnmente usados

17. Composición de medios de cultivo comúnmente usados

18. Reguladores del crecimiento comúnmente usados en los medios de cultivos vegetales

19. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Reguladores del crecimiento • Grupos básicos de reguladores del crecimiento: • Auxinas • Citocininas • Giberelinas • Acido abscísico • - Etileno • Generalidades: • - Actúan a bajas concentraciones • - Interactúan unos con otros (los resultados • están determinados por las concentraciones • relativas entre las diferentes fitohormonas). • - Los reguladores endógenos del crecimiento • están presentes en la planta durante todo • su ciclo de vida pero su concentración fluctúa. • Su concentración relativa varía en función • del estado fisiológico de la planta y en cada • uno de los órganos de ésta. • - Están involucrados en numerosos procesos • fisiológicos.

20. O OH N Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Auxinas: estos compuestos se emplean básicamente como promotores de la proliferación celular y la inducción de la morfogénesis Acido indol acético (AIA) (auxina endógena) • Las auxinas fueron descubiertas entre 1933 y 1935 a partir de bioensayos realizados para caracterizar el mensajero químico responsable de la elongación y de la respuesta fototrópica del coleóptilo de gramíneas. • - Alargamiento y división celular • - Crecimiento de secciones de hojas, tallos y frutos • - Formación de raíces adventicias • - Dominancia apical • - Acción herbicida • - Estimulación de la producción de etileno • Se sintetizan en las yemas, las hojas jóvenes, los frutos y en el embrión. La concentración endógena en la planta varía entre 0,001 y 0,1 mg·Kg-1. • Su transporte es polar • Auxinas sintéticas: • - Acido indol butírico (IBA) • - Acido naftalen acético (ANA) • - 2,4-diclorofenoxiacético (2,4-D)

21. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Citocininas: en combinación con las auxinas, determinan diferentes respuestas morfogenéticas • Fueron descubiertas en 1955 estudiando sustancias promotoras de la división celular in vitro. • Están involucradas en variadas respuestas fisiológicas: • - Promoción de la división celular • - Promoción de la organogénesis (relación • auxinas/citocininas) • - Retardo de la senescencia • - Síntesis de clorofila y desarrollo de cloroplastos • Citocininas endógenas: • - Zeatina (Zea) • - Isopenteniladenina (2iP) • Citocininas sintéticas: • - Cinetina (Kin) • - Benziladenina (BAP) • Se sintetizan en el embrión y las raíces; se encuentran • en todos los tejidos. La concentración endógena en plantas varía entre 0,1 y 500 g·Kg-1. • Su transporte es no polar.

22. Estructura química de las principales citocininas

23. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Las giberelinas se utilizan para favorecer el crecimiento y el alargamiento de los entrenudos de los brotes de novo Acido giberélico (GA3) • Aisladas del hongo Gibberella fujikuroi, a partir de plantas de arroz infectadas. Estas plantas presentaban marcada clorosis y largos entrenudos. Los primeros ensayos se llevaron a cabo usando extractos solubles del hongo. • El ácido giberélico (GA3) fue la primera giberelina identificada. En la actualidad se conocen alrededor de 50 diferentes giberelinas. • Algunos efectos mediados por las giberelinas son: • - Promoción del crecimiento en plantas de genotipos enanos • o plantas bianuales • Crecimiento de yemas latentes • Germinación de semillas en dormancia • - Floración • - Movilización de reservas en la semilla. • Se sintetizan en hojas jóvenes, yemas y en el embrión. • Su transporte no es polar.

24. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Etapas del cultivo in vitro de plantas superiores

25. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales • Iniciación • - Elección y fitoacondicionamiento de la planta madre • - Elección del explante inicial y de la formulación • del medio de cultivo • - Desinfección superficial de los explantes • - Establecimiento del cultivo in vitro • Multiplicación • - Multiplicación del material stock • Enraizamiento • - Enraizamiento de los brotes obtenidos in vitro • Rusticación • - Pasaje de las plantas crecidas in vitro a las condiciones de maceta o a campo Etapas de la micropropagación vegetal

26. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Existen dos posibles vías morfogenéticas implicadas en la diferenciación de novo de brotes y/o plantas completas • Posibles vías morfogenéticas: • - Organogénesis • - Embriogénesis • Diferencias entre las dos posibles vías: • - La organogénesis es de origen pluricelular. Un grupo o cluster de células del explante inicial se desdiferencía inicialmente para luego rediferenciarse dando lugar a un órgano vegetal. No se obtienen por esta vía plantas completas directamente. • - La embriogénesis se presupone de origen unicelular. • Una célula del explante se aísla y constituye el punto • de partida para la obtención de un embrión somático. • Se diferencian embriones o estructuras bipolares • que completan cada una de las etapas implicadas • en la ontogenia de un embrión cigótico. El resultado es una planta completa.

27. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Etapas implicadas en el protocolo de micropropagación de una especie vegetal Elección de una planta madre selecta Explantes ETAPA 1 Desinfección superficial Establecimiento en medio de cultivo apropiado Transferencia a un medio de multiplicación ETAPA 2 Formación de brotes o embrioides Transferencia a un medio para el enraizamiento de los brotes ETAPA 3 Pasaje a maceta en un invernadero ETAPA 4

28. Elección del explante inicial

29. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Los explantes deben ser esterilizados antes de ser establecidos en condiciones de cultivo Protocolo tipo de esterilización superficial de material vegetal: - Etanol 70%, entre 5 y 10 segundos. - Solución de hipoclorito de sodio (NaCIO) al 5 a 20%, entre 5 y 30 min Este paso puede ser reemplazado por el uso de soluciones diluídas de bicloruro de mercurio (HgCl2), entre el 0,01 y 0,05%. - Enjuagues con abundante agua estéril (4 ó 5 veces). - En el caso del HgCl2, el material se debe enjuagar sucesivas veces pues es difícil de eliminar.

30. Posibles respuestas de los cultivos vegetales in vitro

31. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Vías morfogenéticas: organogénesis y embriogénesis

32. Propagación vegetativa por embriogénesis somática

33. Embriogénesis: Obtención de semillas artificiales Semillas sintéticas de orquídea obtenidas por encapsulación en alginato

34. Sistemas de micropropagación vegetal

35. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de yemas axilares o apicales

36. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Propagación vegetativa a partir de yemas preexistentes • Proliferación de yemas apicales o axilares • - Consiste en la multiplicación de plantas a partir • de las yemas axilares preexistentes. • Representa la aceleración in vitro del crecimiento • natural de dichos meristemos. • - La tasa de multiplicación (t.m.) se calcula con • base en el número de brotes o vástagos obtenidos a partir de un explante inicial, entre una resiembra • y otra sucesiva. Esta tasa puede variar entre 2 y 20 brotes por mes, dependiendo de la especie • en cuestión, entre otras variables. • - Por ejemplo, con una t.m. de 5/mes podrían obtenerse 10.000.000 plantas en un solo año, • a partir de una única yema inicial. • - El cultivo de meristemos es un caso especial • del uso de esta técnica.

38. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Sistemas de micropropagación vegetal Proliferación de tejidos desdiferenciados

39. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Resulta posible regenerar brotes o yemas a partir de tejidos vegetales desdiferenciados in vitro • Consideraciones generales: • - Callo: masa de células desdiferenciadas • obtenidas a partir de un explante cultivado • in vitro (disco de hoja, meristemo, • células en suspensión, etc.) • - Es posible regenerar brotes o vástagos a partir • de estos callos. • - Las plantas diferenciadas pueden • no ser uniformes, debido al posible desarrollo de variantes somaclonales. Esto debe tenerse en cuenta, especialmente cuando se trabaja en propagación clonal a gran escala.

40. Sistemas de propagación vegetativa in vitro Regeneración directa e indirecta

41. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Sistemas de propagación vegetativa in vitro

43. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Sistemas de micropropagación vegetal Cultivo de meristemos

44. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Los meristemos son grupos de células indiferenciadas que retienen la capacidad de dividirse durante todo el ciclo de vida de una planta Los meristemos determinan el crecimiento de la planta y dan origen a sus diferentes órganos • Posibilitan la micropropagación de diferentes especies vegetales. • Constituyen el explante ideal para liberar de patógenos in vitro a plantas infectadas por virus, hongos y/o bacterias. • Son ampliamente utilizados como explantes para la criopreservación y conservación de germoplasma.

45. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales En el cuerpo de una planta se reconocen diferentes tipos de meristemas • Meristemos apicales - Están localizados en la porción terminal o distal del vástago y de la raíz. • - Sus divisiones dan lugar a las células de los tejidos • pimarios del tallo y la raíz. • - Son organogénicos. • - Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces. • Meristemos secundarios - Determinan el crecimiento radial de los órganos vegetales. - Dan lugar a los tejidos de conducción. • Meristemos florales - Derivan de la transformación de meristemos apicales. - Se limitan a la producción de órganos florales. • Meristemos intercalares - En el curso del desarrollo de la planta, persisten restos de los meristemos apicales intercalados en los tejidos maduros. • - Determinan el crecimiento en largo de tallos y raíces

46. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales El empleo de los meristemos como explantes del cultivo in vitro constituye una posible herramienta para el saneamiento de plantas infectadas Cultivo de meristemas

47. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales El cultivo de meristemos facilita la eliminación de patógenos • - El domo meristemático no está vascularizado • (muchos patógenos se translocan por los tejidos • de conducción). • - El número de partículas virales es menor • en los meristemos que en otros tejidos (White, 1934). • - La velocidad de división celular a nivel del meristema es mayor que la velocidad de replicación de un virus. • - Las primeras plantas saneadas a partir del cultivo • de meristemos fueron obtenidas por Morel y Martin entre 1952 y 1957 a partir de cultivos de papa y • Dahlia.

48. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Aspectos técnicos del cultivo de meristemas • Equipamiento • - Elementos generales para cultivo in vitro. • - Lupa estereoscópica. • - Instrumental de disección. • Etapas del cultivo - Elección del explante: escencialmente meristemos apicales de vástago. Domo meristemático desnudo o acompañado por 2 ó 3 pares de primordios foliares. Tamaño aproximado 0,5 mm. - Esterilización de la yema o porción apical del vástago conteniendo al meristemo propiamente dicho. - Disección del meristemo bajo lupa. Eliminación de las primeras hojas. - Transferencia del explante al medio de cultivo semi-sólido. - Regeneración de yemas axilares. Subcultivo a medio sin hormonas para la obtención de plantas completas. - Propagación del material (a partir de estacas uninodales, etc.) - Rusticación. Asp

49. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Consideraciones prácticas sobre el cultivo de meristemos • La eficiencia del cultivo de meristemos como procedimiento para la obtención de plantas sanas dependerá del tamaño del explante. • Existe una situación de compromiso entre el tamaño mínimo posible del meristemo y su capacidad de desarrollar y prosperar durante el cultivo in vitro. • Ejemplos prácticos: • - Frutilla (Fragaria sp) / ¿patógeno?: • Explantes de 0,22 mm; 100% de plantas sanas. • - Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus X: • Explantes de 0,1 mm (o menor); 10% de plantas sanas. Si el explante incluye 2 pares de primordios • el % de plantas sanas es menor. • - Papa (Solanum tuberosum) / Potato virus Y o V: • Se obtienen altas eficiencias de saneamiento cultivando explantes de no más de 2 pares • de primordios foliares.

50. Agrobiotecnología Cultivo de tejidos vegetales Alcances de la micropropagación vegetal • Propagación vegetativa rápida y a gran escala • Uniformidad seleccionada del material clonado • Multiplicación de plantas recalcitrantes • a las técnicas convencionales • Reducción en el tiempo de multiplicación • y en el espacio requerido para tal fin • Mayor control sobre la sanidad del material • propagado • Introducción rápida de nuevos cultivares • Conservación de germoplasma • Facilidades para el intercambio internacional • de material vegetal