DNA replikatsioon eukarüootides

1. DNA replikatsioon eukarüootides • DNA replikatsiooni eukarüootides iseloomustavad: • Tuhanded erinevad replikatsiooni origin’id, millel puudub konsensus DNA järjestuse tasemel. Vaid pagaripärmil (S. cerevisiae) ja temaga väga lähedastel liikidel omavad origin’id konsensusjärjestust. • DNA sünteesi initsiatsiooni ajastus erinevatelt origin’delt on erinev. On origin’e, mis on aktiivsed S-faasi alguses, on neid, mis on aktiivsed hiljem. • Origin’ide kasutamine sõltub rakutüübist, organismi arengustaadiumist, kasvutingimustest ning on vähemalt osaliselt reguleeritav epigeneetiliste faktorite poolt. Näiteks heterokromatiinis olevad origin’id on alati hilised, või kui pärmis on muteeritud HDAC Rpd3 (mis viib kokkuvõtteks histoonide suurema atsetüleerituseni), siis paljud hilised origin’id muutuvad varasemeteks.

2. DNA replikatsiooni origin

3. DNA replikatsioon eukarüootides Replikatsiooni initsiatsioonil on eriti olulised kaks valgukompleksi: ORC (origin recognition complex) ja MCM (minichromosomal maintenance). ORC koosneb kuuest valgust (Orc1-6), seondub replikatsiooni origin’idele ning toob sinna kohale teisi faktoreid, mis kõik kokku moodustavad pre-replikatsiooni kompleksi (pre-RC). MCM koosneb samuti kuuest valgust (Mcm2-7) on replikatiivne DNA helikaas, mis vajalik DNA avamiseks replikatsiooni origin’il ning DNA sünteesi initsiatsiooniks ja elongatsiooniks. MCM on see, kes tegelikult replikatsiooni käima lükkab. MCM-i toomine origin’ile = replication licensing. pre-RC moodustumiseks on vaja, et ORC kompleks seonduks valkudega Cdc6 ja Cdt1, mille tulemusena tuuakse kohale MCM kompleks. Cdt1 on keskne valk, mille kaudu reguleeritakse pre-RC moodustamist (kuna MCM seondub pre-RC-le Ctd1 kaudu).

4. Pre-RC moodustumine 1. ORC kompleks seondub origin’iga 2. Cdc6 seondumine 3. Cdt1 seondumine 4. MCM kompleksi toomine origin’ile ORC, Cdc6 ja Cdt1 on vajalikud MCM-i DNA-le laadimiseks.

5. Replikatsiooni initsiatsioon Kui MCM kompleks on paigas, siis on origin valmis replikatsiooni initsiatsiooniks. Järgmisena seondub MCM kompleksiga valk Mcm10, mis on vajalik DDK (Dfb4-dependent kinase) kinaasi seondumiseks. DDK fosforüleerib mitmeid valke, kuid muuhulgas ka MCM kompleksi. Lisaks on vaja ka teist CDK kinaasi, mis fosforüleerib valke Dbp11 ja Drc1, neist esimene seondub DNA polümeraas e (epsilon)-ga. Mõlemad fosforüleerimised töötavad sama eesmärgi nimel: tuua kohale valk Cdc45, mis “käivitab” MCM kompleksi helikaasse aktiivsuse ning DNA-d hakatakse lahti keerama. Järgmisena seondub ssDNA-d siduv ja stabiliseeriv valk RPA, millele järgneb DNA polümeraas a-primaasi kompleks. Protsessiivseks DNA sünteesiks kasutatakse DNA polümeraas d. DNA polümeraas d efektiivseks tööks on vajalik ka PCNA kompleks, mis liigub polümeraasiga kaasa ning moodustab nn “klambri” ümber äsja sünteesitud DNA. PCNA on oluline ka paljude valkude seondumiseks replikatsiooni kompleksiga. PCNA laadimiseks on vajalik “klambrit laadiv” kompleks, milleks on RFC (replication factor C; koosneb viiest subühikust).

7. RFC ja PCNA

8. Replikatsiooni kontrollsüsteemid Replikatsioon peab vastama kahele olulisele tingimusele: 1. Kogu DNA peab saama replitseeritud. Selle tagavad arvukad origin’id. 2. Mitte ükski osa DNA-st ei tohi replitseeruda rohkem kui üks kord ühe S-faasi jooksul.

9. DNA replikatsiooni “licensing” Licensing tähendab seda, et origin’ile on antud “luba” replikatsiooni initsiatsiooniks. Praktiliselt tähendab see MCM kompleksi seondumist origin’ile. “Licensing” toimub mitoosi lõpus ja G1 faasis. Replikatsiooni käigus “luba” (=MCM kompleks) eemaldatakse.

10. Replikatsiooni kontrollsüsteemid Re-replikatsiooni vältimiseks on kolm võimalust:

11. Re-replikatsiooni kontrollsüsteemid 1. Cdk-sõltuv pre-RC moodustumise inhibeerimine. See on peamine mehhanism pre-RC reguleerimiseks pärmis. Cdk on aktiivne G2 ja M faasis, fosforüleerib muu hulgas ka pre-RC komponente, mis kokkuvõtteks viib kas nende lagundamiseni või inhibeerib nende seondumist DNA-le. 2. Geminiinist sõltuv regulatsioon on peamine pre-RC regulatsioonisüsteem kõrgemates eukarüootides. Geminiin seondub Cdt1-ga ega lase sellel MCM kompleksiga seonduda. Samas jällegi geminiin stabiliseerib Cdt1 valku. Geminiin lagundatakse mitoosi lõpus, muul ajal on ta olemas. Kokkuvõtteks tähendab see seda, et MCM-i saab DNA-le tuua ainult vahetult peale mitoosi, G1 faasi alguses. 3. Cdt1 lagundamine replikatsiooni käigus. See on alternatiiviks geminiini süsteemile. Pole teada, kui olulist rolli see süsteem rakkudes täidab.

12. Kokkuvõte replikatsiooni kontrollsüsteemidest

13. Nukleosoomide süntees DNA replikatsiooni käigus Replikatsioonil kahekordistatakse kogu genoomne DNA ning selle pakkimiseks on vaja lühikese aja jooksul suur hulk uusi histoone. Inimese raku DNA replikatsioonil tuleb S faasi ajal sünteesida umbes 30 millionit uut nukleosoomi. Uued nukleosoomid pannakse DNA-le kohe, kui piisav kogus DNA-d on valmis, umbes 150-300 aluspaari. See saab toimuda suuresti tänu sellele, et üks nukleosoome paigaldav faktor, CAF-1 (chromatin assembly factor 1), seondub PCNA-le ning asub seega otse sünteesiva DNA polümeraasi taga. Histoone tuleb sünteesida replikatsiooni ajal, sest “vabu” histoone rakku kuhjata ei saa. Histoonid hakkaksid mittespetsiifiliselt DNA-ga seonduma ja põhjustaksid DNA “kokkukleepumist”. Seetõttu tuleb histoone sünteesida just õige kogus, piisavalt et DNA-d pakkida, kuid mitte rohkem. Olukorra teeb keerulisemaks asjaolu, et DNA süntees ei toimu kogu S-faasi vältel samasuguse intensiivsusega.

14. Histoonide sünteesi reguleerimine Histoonide hulka rakus reguleerivad: 1. Histoonide geenide promootorid on aktiivsed ainult S-faasis. Muul ajal on histoonide geenid represseeritud Hir (Hir1-3, Hpc2) valkude poolt. Täpne mehhanism pole teada, kuid repressioon sõltub histoonide promootoris olevast spetsiifilisest DNA järjestusest. 2. Histoonide mRNA on stabiilne ainult S-faasis ning nende efektiivseks translatsiooniks on vaja, et histooni mRNA-ga oleks seondunud valk SLBP (stem loop binding protein), mis on olemas ainulr S-faasis. SLBP on vajalik U7snRNP seondumiseks, mis omakorda toob kohale histoonide mRNA protsessinguks vajaliku nukleaasi 3. Üleliigsed histoonide valgud lagundatakse. Vabade histoonide äratundmiseks on vajalik kinaas Rad53, mis on oluline valk kogu S-faasi kontrollimisel (vajalik ka replikatsiooni origin’ide kontrollil DNA kahjustuse korral, samuti dNTP-de sünteesi kontrollil).

15. Histoonide abivalgud (histone chaperones) Seonduvad vabade histoonidega ning koostöös nukleosoome remeodelleeerivate faktoritega lülitavad neid nukleosoomide koosseisu. CAF-1 (chromatin assembly factor 1) koosneb kolmest subühikust (p150, p60, p48) ning on võimeline seonduma histoonidega H3 ja H4. Asf1 (anti-silencing factor 1) seondub histoonide H3 ja H4 dimeeriga, blokeerides 2 x H3-H4 tetrameeri tekke. Asf1 koos histoonidega nimetatakse ka RCAF-iks (replication-coupled assembly factor)

16. Histoonide abivalgud (histone chaperones) Nap1 (nucleosome assembly protein 1) seondub eelkõige histoonidega H2A ja H2B. On oluline histoonide transpordil tsütoplasmast tuuma. HIR (histone regulator). Siia rühma kuulub mitu omavahel sarnast valku, neist kõige tuntum on HIRA (pärmis Hir1 ja Hir2). Hir valgud seonduvad kõikide vabade histoonidega, nad on olulised histooni geenide transkriptsiooni represseerimiseks väljaspool S-faasi ning osalevad ka liigsete histoonide lagundamisele suunamisel. Hir valgud on seotud histoonide promootorite regulatsiooniga pärmis. HIRA on oluline nukleosoomide sünteesil väljaspool S-faasi. Ilmselt on HIRA oluline ka nukleosoomilt H2A-H2B dimeeri eemaldamiseks ja seondumiseks transkriptsiooni käigus.

17. Kromatiini sünteesivad valgukompleksid

19. Kromatiin DNA replikatsioonil