FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche

1. FACOLTA’ DI SCIENZE MATEMATICHE FISICHE E NATURALI Corso di Laurea triennale in Scienze Biologiche Curriculum genetico-molecolare Produzione del mutante His100Ala e His104Ala di Orf1, dominio di editing del sistema multienzimatico coinvolto nella biosintesi della 4-clorotreonina in Streptomyces sp. OH-5093 Candidato: Relatori: AnnapaolaAngrisaniDott.ssa Maria Rosaria Fullone 1481918 Prof.ssaIngeborgGrgurina Anno Accademico 2013– 2014

2. 4-clorotreonina Residuo C-terminale della siringomicina in PseudomonassyringaepvsyringaeBR301DR Amminoacido libero in Streptomycessp. OH-5093

3. Sintesi Peptidica Non Ribosomiale (NRPS) Domini catalitici: 1. Adenilazione 3. Condensazione 2. Tiolazione 4. Tioesterasi

4. Reazioni catalizzate dal dominio di adenilazione . I domini in azione sono rappresentati in rosso. Il dominio di adenilazione (A) riconosce e attiva l’amminoacido in una reazione di amminoacil-adenilazione con idrolisi dell’ATP e formazione di un amminoacil-adenilato, rilasciando pirofosfato (PPi). Reazione di amminoacilazione per attacco nucleofilo del gruppo tiolico libero della 4’-fosfopanteteina, inserita sul dominio di tiolazione (PCP), sul gruppo carbonilico dell’amminoacil-adenilato, con formazione di un legame tioestere e liberazione di AMP.

5. Reazione catalizzata dal dominio di condensazione. I domini in azione sono rappresentati in rosso. Il dominio di condensazione (C) catalizza la formazione del legame peptidico, mediando l’attacco nucleofilo del gruppo α-amminico dell’amminoacido accettore, legato al PCP del modulo a valle, sul gruppo tioestere elettrofilo dell’amminoacido donatore, legato al PCP del modulo a monte.

6. Reazione catalizzata dal dominio tioesterasico. I domini in azione sono rappresentati in rosso. Il dominio tioesterasico(TE) media il rilascio del peptide: la serina presente nel sito attivo effettua un attacco nucleofilo sul gruppo tioestere del peptide legato alla fosfopanteteina, in modo da formare un intermedio acil-enzima; questo intermedio verrà poi rilasciato.

7. Il cluster genico coinvolto nella biosintesi della 4-clorotreonina Manca il dominio di condensazione

8. Thr1: • Riconosce ed attiva gli amminoacidi: L-Ser, D-Ser, • D-Ala, L-Val, L-Thre rispettivi stereoisomeri; • Trasferisce gli amminoacidi dall’amminoaciladenilato, formato dal dominio di adenilazione Thr1, sulla 4’-fosfopanteteina legata al dominio di tiolazioneThr2. • Tra tutti gli amminoacidi saggiati, l’ L-Thr mostra la minore KM, ad indicare la maggiore affinità di questo substrato per il sito attivo, e il più elevato valore di kcat/KM;

9. Orf1 • 26% identità con le Ala/Thr-tRNAsintetasiediting domain • di Pyrococcushorikoshii Allineamento di Orf1 di Streptomycessp. OH-5093 con AlaX-M trans-editing e alanil-tRNAsintetasiediting domain di Pyrococcushorikoshii. • Motivi altamente conservati HXXXH e CXXXH, caratteristici di alanil- e treonil- tRNAediting domain: sito di legame dello ione zinco

10. Idrolisi del legame tioestere degli amminoacidi L-Ser, D-Ser, D-Ala, L-Val, NON di L-Thr e rispettivi stereoisomeri; • La presenza di un dominio di editingin un sistema multienzimatico NRPS-simile coinvolto nella sintesi di amminoacidi modificati può giocare un ruolo fondamentale laddove il dominio di adenilazione manchi di una stretta specificità di substrato e siano, al contempo, assenti meccanismi di proofreading.

11. Ruolo del motivo HXXXH: preparazione del doppio mutante His100Ala/His104Ala Templato = pGEMT in cui è clonato il gene orf1 Reazione di mutagenesi sito-specifica: His100 Ala CAC GCC Annealing con primers contenenti mutazione His104 Ala CAC GCA Estensione primers con DNA polimerasi Pfu Turbo Digestione del DNA metilato parentale non mutato con endonucleasiDpnI Kit QuickChange:

12. Campione di reazione ottenuto Trasformazione cellule DH10B di E. coli Sequenziamento Digestione di pGEMTorf1-H100A-H104A con NdeI e HindIII Frammento di DNA contenente gene orf1 mutato recuperato e clonato in pET-28a 3000bp pET28orf1H100A-H104A usato per trasformare cellule BL21(DE3) pGEMTNdeI-HindIII 1000bp orf1H100A-H104A 500bp

13. Accrescimento dei batteri del ceppo BL21(DE3) Espressione di Orf1H100A-H104A indotta con IPTG 0,5 mM Sonicazione per ottenere lisato cellulare Western blotting con uso di anticorpi anti-His sul lisato cellulare del ceppo BL21(DE3)pET28orf1H100A-H104A Orf1H100A-H104A Orf1 H100A-H104A

14. Purificazione di Orf1H100A-H104A mediante cromatografia di affinità su metallo chelante Determinazione della concentrazione della proteina con saggio Bradford Analisi elettroforetica su gel SDS-PAGE della proteina Orf1H100A-H104A 85 kDa 50 kDa 35 kDa Orf1H100A-H104A 25 kDa 20 kDa

15. Studio della funzionalità del mutante Orf1H100A-H104A • Occorre: • far esprimere e purificare le proteine Thr1 e olo-Thr2, necessarie per la preparazione del substrato, seriltioestere-Thr2, per la reazione di idrolisi di Orf1 olo-Thr2 Thr1

16. Rivelare la presenza di gruppi tiolici liberi formatisi dall’idrolisi del seriltioestere-Thr2 mediante l’uso dell’ N-fluorescein-5-maleimide Orf1 NO Orf1

17. Saggio di attività enzimatica 1. Reazione di amminoacilazione sul dominio di tiolazione 2. Blocco dell’attività di Thr1 15 min Aggiunta fosfatasi alcalina per idrolizzare l’ATP • La miscela di reazione contiene: • Thr1= dominio di adenilazione • Thr2= dominio di tiolazione • L-Ser a concentrazione saturante • TCEP= tris (2-carbossietil)fosfina • ATP-Mg2+ 30 min 3. Aggiunta Orf1 wt oppure Orf1H100A-H104A 45 min 4. Aggiunta N-fluorescein- 5- maleimide 7. Irraggiamento su lampada UV ed acquisizione con programma densitometrico 1min al buio 6. SDS-PAGE 5. Blocco della reazione Aggiunta β- mercaptoetanolo

18. Per ogni esperimento viene effettuato un controllo negativo • (L-Ser senza ATP) ed un controllo di reazione senza Orf1. • La reazione è stata condotta a due diverse concentrazioni di Orf1 e Orf1H100A-H104A, 35 μM e 50 μM. • Le medie delle misure di intensità netta di fluorescenza, rilevate con il programma densitometrico, sono state convertite in valori percentuali rispetto al controllo L-Ser senza ATP, posto 100% fluorescente. Orf1 Orf1 Orf1 mut Orf1 mut 6 2 7 8 1 3 4 5 A: Reazione condotta alla concentrazione di 35 μM di Orf1 wt e Orf1H100A-H104A. Linea 1: controllo di reazione in presenza di L-Ser e ATP; linea 2: controllo negativo in presenza di L-Ser senza ATP; linea 3: Orf1 wt; linea 4: Orf1H100A-H104A. B: Reazione condotta alla concentrazione di 50 μM di Orf1 wt e Orf1H100A-H104A. Linea 5: controllo di reazione in presenza di L-Ser e ATP; linea 6: controllo negativo in presenza di L-Ser senza ATP; linea 7: Orf1 wt; linea 8: Orf1H100A-H104A.

19. … solo un decremento funzionale della proteina mutata, non un completo annullamento dell’attività di editing… Perché? In accordo con l’ homology model fornito dal Dott. Paiardini, L-Ser è stabilizzata nel sito attivo dall’interazione con His100 mediante il gruppo idrossilico del substrato. La mutazione di His100 potrebbe comportare una minore stabilizzazione del substrato, perché potrebbe essere ostacolata l’interazione con il gruppo –OH della serina.