水稻胚乳细胞程序化死亡

1. 水稻胚乳细胞程序化死亡 学生：王敏 学号：M05308 导师：顾蕴洁　教授

2. １　选题依据 ２　研究内容 ３　实验材料及方法 ４　年度研究计划及预期研究结果

3. 1、选题依据 PCD是指一种生理性的细胞死亡，是生物体在生长发育的一定阶段、在特定的组织器官中出现的一种主动的、按照一定程序进行的细胞死亡过程，这种细胞死亡通常与基因的有序活动相关。从90年代起，国际上在植物PCD方面的研究日益增多，目前己成为一研究的热点，涉及植物发育生物学的各个领域。但是由于起步较晚，尽管PCD的机制在动物细胞中己有了较深入的研究，植物PCD的研究还不够深入。

4. 水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主食。近来，人们发现水稻胚乳也存在PCD现象。胚乳贮藏的淀粉是构成水稻籽粒的主要成份。水稻是世界上最主要的粮食作物之一，全球约有一半以上的人口以稻米为主食。近来，人们发现水稻胚乳也存在PCD现象。胚乳贮藏的淀粉是构成水稻籽粒的主要成份。 　　因此，探明水稻胚乳细胞程序化死亡过程，弄清无核的胚乳细胞的充实机理，对水稻栽培，以及生理学解剖学等方面都具有极其重要的意义。

5. 1.1 水稻胚乳细胞的发育和结构特点 胚乳发育可分为４个时期： a 游离核胚乳期　开花后2~3 d为游离核胚乳期。 b 胚乳细胞化期　此期包括游离核间形成垂周壁至中央细胞被胚乳细胞充满。 c 胚乳细胞生长分化期　此期包括糊粉层、亚糊粉层及淀粉胚乳细胞的生长与分化。 d 胚乳成熟期　糊粉层、亚糊粉层及两种类型的淀 粉胚乳细胞分化成熟，胚乳达蜡熟。

6. 花后第3天胚乳已完成细胞化 ，此时胚乳细胞开始启动PCD过程，细胞核的变化最为剧烈。细胞核从有到无，10天左右，胚乳细胞完成去核过程，无核的胚乳细胞继续进行淀粉和蛋白质的充实以及糊粉层和转移细胞的分化。

7. 开花后3天的淀粉胚乳细胞，核正常，核周围有处于早期的淀粉质体。细胞质稀淡，多液泡。 开花后7天的淀粉胚乳细胞，核向大淀粉体之间的间隙任意延伸为叶裂状，核膜多处崩溃，核质外泄。 开花后6天淀粉胚乳细胞，核与大淀粉体相邻处核膜已消失，其余处的核膜多处崩溃，核质外泄。

8. 　　成熟水稻胚乳细胞中充满了淀粉粒。由于在积累过程中相互在三维空间上的挤压，每个淀粉粒皆呈多边形球体，中间有空腔存在。因此，每个淀粉粒都是空球体。约占淀粉体积的1/8左右。

9. 1.2 水稻胚乳细胞充实途径 　　水稻在花后1-3d内,子房背部维管束还未发育完全，此时胚乳核分裂以及核间的细胞壁形成所需养分主要是由珠心细胞与反足细胞提供。这些细胞在把养分供给胚乳核后自身退化或消亡。

10. 　　在进入细胞期后，特别在灌浆叶旺盛的乳熟期和蜡熟期，颖果中向胚乳和胚运送的养分途径 ： 退化珠心层 糊粉层 内胚乳 背部维管束 养分 珠心突起 珠心组织 胚乳的四周 内胚乳 糊粉层

11. 1.3 水稻胚乳细胞的生理功能及营养　　价值 在子粒充实过程中作为储藏库来积累淀粉。 在种子萌发时能够提供足够的营养物质。 胚乳中含有大量的淀粉蛋白质，是人们摄取此类营养的主要来源。

12. 2 研究内容 胚乳细胞PCD过程形态观察 　　对不同发育时期的胚乳细胞进行超薄切片，观察胚乳细胞程序性死亡的全过程。 胚乳细胞充实机理 　　探明胚乳PCD过程的控制因素，灌浆物质充实路径及稻米品质影响的原因。

13. 3、实验材料与方法 材料：供试品种为二优118，9538及扬稻6号。 方法：田间分期播种，设置小区施氮做对照，大田管理。采用点颖与挂牌相结合的方法来标记颖花的开花日期与授粉时刻。

14. 试验内容 I-IK，TTC染色 Evan's blue染色法检测细胞死亡 籽粒增重测定 供光镜和透射电镜(TEM)观察的样品制作 细胞壁的荧光观察 供扫描电镜(SEM)观察的样品制作 发育期间水稻淀粉胚乳DNA电泳

15. ３.1 I-IK，TTC染色 I-IK可以将淀粉染成兰色，TTC可以将活性大的部位染成红色，能够初步观察胚乳细胞发育过程中淀粉的充实过程和生理特性。

16. 　　花后３天水稻颖果I-IK染色。淀粉开始充实，但是颗粒较小。　　花后３天水稻颖果I-IK染色。淀粉开始充实，但是颗粒较小。 　　花后１６天水稻颖果I-IK染色。颖果已经充分发育，淀粉充实较多，颗粒大。

17. 　　花后２０天水稻颖果ＴＴＣ染色。胚和背部维管束部分颜色最红，活性最高，代谢旺盛。胚乳细胞亦被染色，颜色较浅，活性较底。　　花后２０天水稻颖果ＴＴＣ染色。胚和背部维管束部分颜色最红，活性最高，代谢旺盛。胚乳细胞亦被染色，颜色较浅，活性较底。

18. 3.2 Evan's blue染色法检测 子粒 剖面 浸染 冲洗 观察 Evan‘s blue具有将死细胞染成兰色的特性,以次可以判断PCD发生的部位以及发生的顺序.

19. 3.3 籽粒增重测定 　　开花后第6天开始取样，每隔5天取样1次，每次取标记籽粒100粒，1050C下杀青30min后80℃下烘至恒重，剥去颖壳称糙米重，计算其平均籽粒增重速率及含水量的变化 。

20. ３.4 透射电镜(TEM)观察的样品制作 取样 前固定 后固定 脱水 TBO染色 半薄切片 包埋 置换 光镜观察 超薄切片 双重染色 电镜观察

21. 3.5 细胞壁的荧光观察 用紫外荧光可以观胚乳细胞自由壁的形成过程，这种方法不但直观可靠，而且更是简单方便 。 取材 固定 包埋 制片 观察 紫外照射 清洗 荧光染色

22. 　　授粉后55 h，示胚(eb)周围的自由壁(白箭) 授粉后3d，自由壁(白箭） 　　示胚乳细胞壁由胚囊边缘( fr)向中央(ce)扩展

23. 　　花后３天冰冻切片荧光照片。（荧光增白剂）　　花后３天冰冻切片荧光照片。（荧光增白剂） 花后５天冰冻切片荧光照片。

24. 3.6　供扫描电镜(SEM)观察的样品制作 前固定 后固定 二甲亚砜过渡 丙酮脱水 醋酸异戊酯过渡 液氮断裂 SEM观察 CO2临界点干燥 离子溅射镀金

25. 3.7发育期间水稻淀粉胚乳DNA电泳 　　通过胚乳细胞发育不同时期的DNA电泳，可以准确判断核酸的降解情况。 材料 液氮处理 研磨 抽提DNA 去蛋白 观察 EB染色 电泳 TE溶解 沉淀DNA

26. ４、年度研究计划及预期研究结果 ４.1 研究计划 • 06年，完成第一阶段的材料的初步收集，将不同发育时期 的水稻子粒包埋，并进行I-IK，TTC染色，树脂切片等，初步探讨胚乳的PCD及充实过程及生理功能。 • 07年，对不同发育阶段的水稻子粒进行生理活性，组织化学鉴定。深入探讨胚乳细胞的形成分化过程，以及影响充实的调控影响因素。最后，汇总实验结果，撰写高质量的论文，提交总结报告.。

27. ４.2 预期研究成果 从超微结构上阐明水稻胚乳细胞PCD过程 弄清胚乳PCD过程的调控分化因素 探明无核胚乳细胞的充实过程及影响因素

28. 敬请批评指正 谢谢