植物学专题讨论

1. 植物学专题讨论 高等植物 厌氧适应的生理及分子机制 孔妤 2005.11.10

2. 前 言 • 氧是细胞线粒体膜上电子传递的最终受体，驱动能量梭子ATP合成，构成整个植物生命体代谢的核心，所以植物活细胞生长代谢等需要适当浓度的氧。但在自然界有不少植物能够适应持续或间断性的根际厌氧环境，如水稻和许多生长繁茂的湿生植物。水分变化常常影响植物类型与种的分布，过多的降雨与灌溉不均匀也都影响农田作物的产量。

3. 湿生植物如何适应根际厌氧环境? 探讨的问题 如何解释植物细胞的厌氧胁迫机理？ 通过遗传改良和农艺措施怎样克服旱生植物由于渍水造成的产量损失? 这些研究在生态学与生产上都有一定的意义。植物细胞在感受厌氧信号后，启动和关闭一些基因，引发一系列的生化、生理及形态结构变化，以持续个体存活。这些反应大致可以分为主动适应和被动适应两个方面。渍水导致植物生长量及营养元素吸收能力的减低；某些物质如酶类，激素水平的下降等次级过程已有不少报道。本文侧重于讨论植物在厌氧下以缓减胁迫为目的的主动适应机制。 探讨的意义

4. 1.1 根际变化 通常由于土壤渍水造成氧的迅速耗竭并引发相关的物理、化学、电化学、生物区系及土壤肥力的综合变化。氧在水中的运动速率为空气中的万分之一。由于缺氧，土壤电化势(Eh)下降，还原性金属离子特别是Fe2+、Mn2+积累，CO2浓度升高，有机还原性物质产生。厌氧后根际微生物种群发生演变，好气性微生物为嫌气性微生物代替，细菌繁殖快于真菌及放线菌，植物的促生性菌根类一般受到抑制。总之，从植物根系与土壤关系看，厌氧除O2本身的胁迫外，还导致营养元素无效化，以致土壤肥力下降。 1 厌氧下的植物根际变化及厌氧胁迫机理

5. 以水稻为例，水稻在长期的系统发育过程中,在结构和功能上都形成了对少氧或缺氧环境的特殊适应能力,但长期淹灌同样不利稻根的生长和发育。当根表氧浓度低于0.001mol/m3时,根停止伸长。铁毒、H2S、有机酸等对稻根生长及代谢均有极大的影响,而这些有毒物质量与土壤含氧量是密切相关的。以水稻为例，水稻在长期的系统发育过程中,在结构和功能上都形成了对少氧或缺氧环境的特殊适应能力,但长期淹灌同样不利稻根的生长和发育。当根表氧浓度低于0.001mol/m3时,根停止伸长。铁毒、H2S、有机酸等对稻根生长及代谢均有极大的影响,而这些有毒物质量与土壤含氧量是密切相关的。 许多研究表明,缺氧提高自由氨基酸的浓度和转变，这些自由氨基酸的增加,是由于缺氧条件下蛋白质分解和有机酸代谢改变的结果。丙氨酸、γ-氨基丁酸、脯氨酸的积累是水稻在缺氧条件下减少酸中毒的重要因素。淹水缺氧抑制原来的蛋白质的合成产生新的蛋白质和多肽。 实验证明，玉米苗缺氧时形成两类新的蛋白：首先是过渡多肽，后来形成厌氧多肽。后者中有一些是糖酵解酶或与糖代谢有关的酶。这些酶的出现会催化产生ATP，供应能量；也通过调节碳代谢以避免有毒物质的形成和累积。 1.2 厌氧胁迫对根系生理代谢的影响

6. 图1 水涝缺氧主要限制了有氧呼吸，促进了无氧呼吸，产生大量无氧呼吸产物，如乙醇、乳酸等，使代谢紊乱，受到毒害。无氧呼吸还使根系缺乏能量，阻碍矿质的正常吸收。

7. 图2 缺氧种子糖酵解的次要产物。糖酵解途径可以将蔗糖转变为磷酸烯醇式丙酮酸，它可以脱氢生成ATP，也可以脱羧生成草酰乙酸盐和无机磷，丙酮酸转换产生丙氨酸。OAA进入三羧酸循环转变为α-酮戊二酸或琥珀酸盐。前者可以转变形成谷氨酸，然后它可以脱羧生成γ-氨基丁酸盐。

8. 图3 氧气缺乏时玉米根皮层中通气组织的发育。 • 淹水缺氧还促使植物体内形成通气组织，例如，水稻的根和茎有发达的通气组织，能把地上部吸收的氧输送到根部，所以抗涝性就强。而小麦的茎和根缺乏这样的通气组织，所以对淹水胁迫的适应能力弱。但小麦、玉米等根部缺氧,也可诱导形成通气组织。淹水缺氧之所以能诱导根部通气组织形成，主要因为缺氧刺激乙烯的生物合成，乙烯的增加刺激纤维素酶活性加强，于是把皮层细胞的胞壁溶解，最后形成通气组织。 图4 扬稻6号淹水4d后距根尖1.5cm处形成通气空腔。 图5 珍汕97淹水6d后距根尖1.5cm处形成大面积通气空腔。 图6 渍水10d以上小麦根成熟区皮层内均匀形成气腔。

9. 植物厌氧胁迫机理的学说有6种： 1.3 厌氧胁迫的生理机制 • 能量耗竭学说； • 糖酵解与发酵代谢末端产物积累学说； • 细胞质酸化学说； • 厌氧后氧自由基伤害假说； • 土壤还原性物质毒害学说； • 能源物质缺乏说。

10. 厌氧下根细胞中乳酸发酵产生初始酸化，随之ATP水平和液泡膜上的H+-ATP酶活性下降，于是发生质子渗漏，导致细胞质酸化。一般认为这些就是细胞厌氧下死亡的主要原因。厌氧下根细胞中乳酸发酵产生初始酸化，随之ATP水平和液泡膜上的H+-ATP酶活性下降，于是发生质子渗漏，导致细胞质酸化。一般认为这些就是细胞厌氧下死亡的主要原因。 支持这一理论的证据有:长期耐厌氧环境的白菖(Acoruscalamus)根中积累的大量碱性氨基酸精氨酸可有效缓解胞质中pH下降；玉米乙醇脱氢酶(ADH1)缺失突变体的发酵能力减低，根细胞中pH值下降快，死亡早于野生型等。特别是Roberts用13C与31P核磁共振(NMR)法，原位测出厌氧下玉米根中细胞质与液泡中pH下降的结果支持了这一学说。

11. 2.1 形态适应 2.1.1 通气组织的形成 通气组织（aerenchyma）是植物薄壁组织内一些气腔或空腔的集合。在厌氧下植物根皮层细胞常发生编程性死亡，生成通气组织，把氧气运送到根基部，以保证根的代谢需要，这一过程对于植物在缺氧条件下的生长具有重要的意义，是植物的一种重要的避缺氧机制。 2 植物厌氧适应的策略

12. 图7 通气组织的形成可以不是被缺氧而是低氧刺激。ACC到乙烯的转化需要氧的存在。乙烯产生导致根皮层细胞中一系列相关酶厌氧诱导表达，细胞液泡化，细胞壁微纤丝断裂重接，使中皮层细胞中央贯通，形成大的通气腔。且周围仍有细胞质流，并不影响离子吸收和运输。

13. 2.1.2 形成不定根 在厌氧下许多植物初生根受到伤害或死亡，但在靠近地面处能产生许多新生的不定根。这一现象乃是由于近地表O2分压较高所致，也可由乙烯诱导生成，但不同植物之间的差异很大。不定根产生的多寡反映了植物的适应能力，是许多旱生植物中耐渍基因型的重要标志。 图8 岑树幼苗淹水后茎的不定根和过度生长的皮孔。黑色箭头表示淹水的深度。

14. 这完全受乙烯调节，茎叶延伸可使水生植物获得更多的光合面积，伸出水面完成生殖过程，也是避缺氧的一种机制(如深水稻或称浮生稻)。这完全受乙烯调节，茎叶延伸可使水生植物获得更多的光合面积，伸出水面完成生殖过程，也是避缺氧的一种机制(如深水稻或称浮生稻)。 2.1.3 水生植物茎叶的延伸生长 图9 水稻秧苗对淹水深度的生长反应示意图。秧苗在每年度洪水淹没之前定植好。淹水可以促进节间的快速伸长和不定根的发育。一旦洪水减退秧苗的不定根会向土壤中伸长生长，生活在空气中的植株部分向上生长。

15. 2.2.1无氧呼吸的启动 缺氧触发旱生植物的糖酵解过程，首先表现为乳酸脱氢酶(LDH)活性升高，乳酸发酵。当胞质中pH值达到6.8时，乙醇脱氢酶(ADH)与丙酮酸脱羧酶(PDC)被激活，迅速进入乙醇发酵途径。无氧呼吸是植物潜在的代谢功能，当根细胞中氧浓度低于某一个阈值--称临界氧分压(COP)，植物自动以还原性中间代谢产物为末端电子受体，能效率显著降低，每分子6-碳糖，只产生2个分子ATP。它可作为一种补救途径以维持细胞存活。物种间以及同一种不同基因型之间无氧呼吸速率有很大的差异。湿生植物除了其它适应机制以外，其无氧呼吸功能强，酶活性高，可以维持较高的能荷水平而正常生长。 2.2 代谢适应 图10 由于缺氧的影响，糖酵解中的丙酮酸首先发酵为乳酸。

16. 2.2.2 代谢途径的平衡 除了糖酵解与发酵代谢外，目前发现一些耐渍类型植物在厌氧条件下还存在多条呼吸代谢途径。这种方式能缓冲细胞质的酸化和避免单一代谢末端产物的积累。主要有以下几种类型: 琥珀酸(Suc)合成 谷氨酸(Glu)转化 丙氨酸(Ala)产生 苹果酸(Mal)代谢

17. 2.2.3 抗氧化机制的启动 主要是一些湿生植物在自然状态下存有较强的抵御缺氧后伤害的机能。Crawford和Braendle将这种内在机理分为诱导酶和抗氧化剂两类。许多湿生植物中有多种抗氧化剂如抗坏血酸(Vc)、α-生育酚(VE)及谷胱甘肽(GSH)等。酶类有超氧物岐化酶(SOD)以及与抗氧化物质合成有关的脱氢抗坏血酸酶(DHAR)、单脱氢抗坏血酸还原酶(MR)等。MR能催化丙二醛(MDA)还原，DHAR则在H2O2的解毒系统中起作用。此外，Biemelt等最近报道，不同耐渍小麦品种之间的抗氧化剂及氧化还原酶水平有显著差异。这说明植物厌氧下抗氧化能力发生改变具有普遍性。

18. 厌氧胁迫下植物体的能量供应骤减，在此情况下植株通过收缩生长或设法增加供氧以获得能量。这一作用是由激素行使的。厌氧下首先触发乙烯增生，诱导通气组织和次生根的形成，以缓解缺氧。根中CTK与GA迅速下降，根的生长速率因此下降；CTK向地上部的运输量减少，以致整株生长速率下降。叶片中ABA积累乃是老叶合成增加的一种反映，转运到幼叶中诱导气孔关闭，蒸腾减少，生长受抑，老叶萎枯以适应存活。在个体水平上，由于根系厌氧的胁迫，地上部光合作用受阻，糖合成减少，因而茎叶及生殖生长均减慢。叶片在缺氧30～40min的时间内生长即减慢，如此快的反应乃是激素控制的主动调节反应。厌氧胁迫下植物体的能量供应骤减，在此情况下植株通过收缩生长或设法增加供氧以获得能量。这一作用是由激素行使的。厌氧下首先触发乙烯增生，诱导通气组织和次生根的形成，以缓解缺氧。根中CTK与GA迅速下降，根的生长速率因此下降；CTK向地上部的运输量减少，以致整株生长速率下降。叶片中ABA积累乃是老叶合成增加的一种反映，转运到幼叶中诱导气孔关闭，蒸腾减少，生长受抑，老叶萎枯以适应存活。在个体水平上，由于根系厌氧的胁迫，地上部光合作用受阻，糖合成减少，因而茎叶及生殖生长均减慢。叶片在缺氧30～40min的时间内生长即减慢，如此快的反应乃是激素控制的主动调节反应。 2.3 细胞和个体生长发育的激素调节

19. 有许多证据表明，旱生植物的厌氧适应能力受低氧预处理的诱导。植物种间耐厌氧性的遗传差异乃是植物根系长期适应不同氧分压进化的结果，湿生植物的这一适应能力强于旱生植物。同一种植物品种间的遗传差异亦有类似的适应过程。但植物具有潜在的适应厌氧环境的能力，低氧信号能激活某些厌氧反应基因的表达，使同一种基因型的耐渍能力得到很大的改善。有许多证据表明，旱生植物的厌氧适应能力受低氧预处理的诱导。植物种间耐厌氧性的遗传差异乃是植物根系长期适应不同氧分压进化的结果，湿生植物的这一适应能力强于旱生植物。同一种植物品种间的遗传差异亦有类似的适应过程。但植物具有潜在的适应厌氧环境的能力，低氧信号能激活某些厌氧反应基因的表达，使同一种基因型的耐渍能力得到很大的改善。 Xia与Saglio通过对玉米根部控制氧浓度，研究了低氧驯化适应的可能原因。指出低氧诱导呼吸酶类(如ADH和PDC)活性升高，从而维持较高的ATP与能荷水平，且也有利于控制细胞质中pH的稳定。有人在大田淹水及实验室控制供氧下，研究芝麻根结构和呼吸酶活性变化的结果表明，低氧锻炼可以诱导与根结构变化相关的基因表达，产生通气组织与不定根，从而使根中有氧呼吸速率增加，ATP与AEC维持高水平。ADH活性虽有升高，但其升高幅度与品种耐渍强度无一致性。有关植物厌氧适应的机制可归纳如下图。 2.4 植物的低氧诱导适应

20. 图11 植物耐渍适应图解

21. 3 植物厌氧适应的分子生物学 3.1 厌氧多肽的分离鉴定 3.1.1 旱生植物中的厌氧多肽 Sachs首次揭示严格厌氧条件下旱生植物根尖合成蛋白质数量锐减的现象。他用双向电泳技术观察到玉米幼苗在缺氧下约有20种多肽(ANPS)，其中10种分子量较大，10种较小。对照则有90余种多肽。ANPS合成在0～1h出现，20h达到最大，此后不再增加，96h玉米幼苗死亡。此后人们相继证明在大麦、木棉、番茄、豌豆和大豆等作物中也有类似的厌氧多肽合成模式，并发现厌氧下某些有氧蛋白的合成受抑制与多聚体的解体有关。再后10余年，人们又通过纯化和测序，证明ADH、PDC、葡萄糖-6-磷酸异构酶(GPI)、淀粉合成酶(SUC)、甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)、烯醇化酶(ENO)、乳酸脱氢酶(LDH)、木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)及甲酸脱氢酶(FDH)等为厌氧蛋白组分。其中大多数为糖酵解与发酵代谢的调节酶，XET是细胞壁松弛有关的酶，它的转录子在淹水12ｈ内的玉米幼苗中有积累，表明该酶参与通气组织的形成。FDH在生物氧化与细胞pH稳定中有专一的作用。

22. 3.1.2 湿生植物中的厌氧多肽 Mujer等分离了湿生植物稗草(Echinochloacomplex)的6个种及水稻根中的厌氧蛋白，发现它们的ANPS不同于旱生植物，数量较多。根据它们产生的条件分为5类: (1)厌氧下合成增强的9～13种； (2)仅在厌氧下产生的1～5种； (3)有氧无氧下均合成； (4)有氧下合成，厌氧下抑制有3～7种； (5)仅在有氧下合成的1～4种。 除了ADH与PDC外，这些厌氧多肽鉴定的报道尚未见， 这对揭示湿生植物的耐厌氧机制极为重要。

23. 3.2 厌氧诱导表达基因的cDNA克隆 Gerlach等在玉米上获得第一个厌氧诱导表达基因的cDNA克隆，为乙醇脱氢酶ADH1的cDNA，全长900bp，C-端有168个氨基酸编码区，N-端有364bp非编码区。采用生物化学方法结合体外翻译获得克隆片段。Northern杂交证明乙醇脱氢酶mRNA水平在厌氧下可增加50倍。此后许多学者又在不同植物上采用不同方法，克隆出一些厌氧表达基因。其中以研究玉米最为集中，有8个厌氧基因已在染色体上定位。迄今仍然不断有新的厌氧表达基因克隆出来。

24. 3.3 一些厌氧诱导表达基因的结构与功能 3.3.1 乙醇脱氢酶基因Adh1和厌氧反应元件(ARE) • 这一基因最早被分离出来，目前至少已在玉米、小麦、大麦、拟南芥、水稻和白菖6种植物上获得Adh1基因全序。植物细胞中均存在两套乙醇脱氢酶基因:一套为组成型Adh2，另一套为厌氧诱导表达型Adh1。 • Walker等报道玉米Adh1基因中，位于起始密码子上游-140～-100区域是厌氧诱导表达的关键，称为厌氧反应元件(ARE)。它有2个亚区，均含有GGTTT核心结构。 • Dennis等分析多种植物的Adh基因启动子区核苷酸的缺失与突变时发现，当Adh1中有多个ARE时，这一基因的厌氧诱导转录水平成倍提高；在组成型的Adh2中亦存在ARE序列，因而认为ARE是调节蛋白结合位点，有类似增强子的作用。他们还进一步证明ARE近傍还存在一个决定转录的关键区--启动子区(称AREF)，它决定调节蛋白的结合与厌氧诱导表达。

25. 3.3.2 甘油醛3-磷酸脱氢酶基因族(Gpc)Gpc是Sachs等在对玉米厌氧多肽GAPDH与热激蛋白HSP35的比较研究中发现的。他们用HSP35克隆检测玉米厌氧下根组织的cDNA文库所获得的杂交片段，后来证明即为Gpc。目前发现有4种GAPDH基因：组成型Gpc1、Gpc2与厌氧诱导型Gpc3、Gpc4。 3.3.3 木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)相关基因XET是一个新发现的参与胞壁代谢的重要酶。其作用是专一性切断木葡聚糖的β-1，4-糖苷键，并将切下的寡聚糖链转接到同类分子末端，这种现象称为切链转移作用。它对细胞壁重建和细胞扩展起重要作用。有人甚至认为它可能是植物生长机制中的核心酶。这是迄今发现的第一个与通气组织形成相关的厌氧表达基因，意味着厌氧适应研究已在分子生物学水平上取得了新进展。 3.3.4 甲酸脱氢酶基因(Fdh)FDH催化甲酸氧化为CO2，并伴随着还原力NADH的再生，是生物氧化的末端反应之一。Suzuki等从大麦根中克隆出Fdh的cDNA，并发现这一基因的表达受缺铁及厌氧双重诱导。Francs认为甲酸代谢可能是存在于非光合组织中的一种尚未明确的代谢途径。这一现象的发现把厌氧与铁代谢联系起来。

26. 3.4 厌氧信号转导 一系列厌氧反应基因随着O2分压的变化而迅速开启或关闭，说明植物体内存在一个有效而精细的O2的感受和信号转化系统，具体可分为两步:第一是感受氧的变化,传递原初信号进而诱导乙烯的合成；第二步,通过乙烯浓度变化引起级联反应--诱导细胞死亡。 图12 在溶生通气组织形成的过程中玉米低氧的信号转导可导致细胞程序性死亡。有氧条件下增加Ca2+浓度的化合物可以促进通气组织的形成，而缺氧条件下阻止Ca2+运动的化合物可以抑制通气组织的形成。

27. 3.4.1 血红蛋白可能是分子氧感受体 血红蛋白作为动物体中O2的运输工具已经得到确认。根据血红蛋白在O2毒害与厌氧下的作用，Terwilliger认为高等植物在厌氧下由血红蛋白感受O2分子，血红蛋白浓度变化受O2分压调节。 3.4.2 厌氧转录因子HIF-1及氧自由基的调节 Semenzy与Wang分离出第一个高等生物的厌氧转录因子HIF-1，其与厌氧基因的结合能力和转录活性受低O2诱导。HIF-1结合到促红细胞生成素(EPO)基因增强子上，即能促进其mRNA表达。但是HIF-1活性受氧自由基(ROI)浓度调节。研究表明，ROI可作为第二信使，参与抗氧化过程的调节。对此Ratcliffe等曾提出一个生物对低氧信号感受的模型，模型中将ROI与HIF-1以及其它相关因子联系起来，较好的解释了O2信号感受与基因的表达。 3.4.3 钙离子参与厌氧信号的转导 Subbaiah等用钕红(RR)(一种Ca转运抑制剂)及45Ca测定的结果间接证明Ca2+对厌氧基因表达是必须的。 Ca2+参与厌氧信号传递。但是对于低氧如何改变胞质中Ca2+浓度，以及Ca信号又如何被厌氧基因接受，迄今尚无明确的解释。

28. 结 语 不良通气条件导致缺氧是高等植物主要的非生物胁迫因素之一，它影响到植物种群分布以及多种农作物产量。因而了解植物遭受伤害的原因及其适应机制有重要的生态与经济意义。 对淹水和湿地条件有良好适应性的湿生植物能够在长期渍水下存活，有两种基本方式:一是厌氧逃避，即通过整株调节(如通气结构产生)从地上部获得根系需要的氧气。这类植物一般有高的生产力，如水稻和湿地生态下生长的植物。另一是耐厌氧，依靠乙醇发酵的开关和其它生化变化。在不同物种和组织中的代谢彼此有差异，耐厌氧能力也不同。 就旱生植物而言，低氧驯化常常能有效地改善其耐缺氧强度，这表明旱生植物的耐渍基因多数是厌氧诱导表达的，在渍水条件下旱生植物的生产力有不同程度下降，所以选育耐渍品种十分重要。

29. 不同植物的厌氧适应的形态、生理及营养代谢的研究。不同植物的厌氧适应的形态、生理及营养代谢的研究。 研究内容更多转向分子生物学领域。 研究材料从栽培植物转向湿生性的野生植物。 研 究 趋 势 厌氧信号转导及受体蛋白研究。

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