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化学分析 电分析 分析化学 原子吸收光谱 仪器分析 光分析 原子发射光谱 吸光光度法 …… 色谱分析. 吸光光度法. 第 10 章. 10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律. 10.2 分光光度计及吸收光谱. 10.3 显色剂及其影响因素. 10.4 吸光光度分析及误差控制. 10.5 其他吸光光度法. 10.6 吸光光度分析法的应用. .
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化学分析 电分析 分析化学 原子吸收光谱 仪器分析 光分析 原子发射光谱 吸光光度法 …… 色谱分析
吸光光度法 第10章 10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律 10.2 分光光度计及吸收光谱 10.3 显色剂及其影响因素 10.4 吸光光度分析及误差控制 10.5 其他吸光光度法 10.6 吸光光度分析法的应用
10-2 nm 10 nm 102 nm 104 nm 0.1 cm 10cm 103 cm 105 cm 射线 x射线 紫外光 红外光 微波 无线电波 可 见 光 吸光光度法:是基于被测物质的分子对光具有选择吸收 的特性而建立的分析方法。 10.1.1 物质对光的选择性吸收 10.1 物质对光的选择吸收和光吸收的基本定律 光的电磁波性质
光的波粒二象性 波动性 E 粒子性
绿 黄绿 蓝绿 黄 橙 绿蓝 蓝 红 紫 紫红 单色光、复合光、互补色光 单色光 ? 复合光 ? 光的互补 ? 问题:光与物质如何发生作用?
物质的颜色与光的关系 复合光 光谱示意 表观现象示意 完全吸收 完全透过 吸收黄色光
1.分子能级图:微观上表现为能级跃迁 E电子 + E振动 + E转动1~200ev 0.05~1ev 0.05ev可见、紫外 红外 红外 2.分子吸收光谱图:宏观上表现为光吸收 (1) KMnO4吸收曲线(2)定性、定量依据 吸光程度 吸收光谱
10.1.2 光吸收的基本定律 透光率定义: 全部吸收 T = 0.0 % 全部透射 T = 100.0 % T ~ ?~ C
I I-dI db b 朗伯-比耳吸收定律的推导 dI ∝ N I N = N0 c dS db I0 It N = k’c db dI ∝ N I = I k’c db dI = - I kc db , dI / I = - kc db 积分 得 或 得
100 50 0 1.0 0.5 0 A T % A C 吸光度与透光率 A: 吸光度 T = 0.0 % T A = ∞ T = 100.0 % A = 0.0
吸光系数 b ~cm c~ g ·L –1或mol ·L –1 K比例常数 物质的性质 入射光波长 温度 摩尔吸光系数 L · mol –1 · cm -1 c:mol ·L –1 K 吸光系数a L · g –1 · cm -1 c: g ·L –1 K a
A 0 C 2+ 3 3 邻二氮菲 桔红色 508 摩尔吸光系数的意义 1.摩尔吸收系数~反映吸光物质对光的吸收能力,取决于 分子结构,是物质定性依据。 2.摩尔吸收系数~反映光度分析方法的灵敏度. < 104 低灵敏度 =104 ~105 =1.1 104 中等灵敏度 > 105 高灵敏度
10.2 分光光度计及吸收光谱 10.2.1 分光分度计 分光光度计基本部件 氢灯,氘灯,185 ~ 350 nm; 卤钨灯,250 ~2000 nm. 光源 玻璃棱镜, 350 ~ 2500 nm 石英棱镜,185 ~ 4500 nm 光栅 单色器 样品池 玻璃比色皿,石英比色皿 检测器 光电管,光电倍增管 信号输出 表头显示、数字显示、屏幕显示、记录
0.575 光源 单色器 检测器 显示 吸收池 单波长单光束分光光度计 (计算机)
比值 光束分裂器 光源 单色器 显示 吸收池 检测器 单波长双光束分光光度计
10.2.2 吸收光谱 KMnO4溶液的吸收光谱
A A C A max C 吸收光谱与吸收定律的关系 吸收定律 吸收光谱 三维谱图
显色反应 2+ 3 3 邻二氮菲 桔红色 max 10.3 显色剂及其影响因素 10.3.1 显色反应与显色剂 官能团强吸收 直接测定 UV-VIS 有机化合物 官能团弱吸收 衍生化反应 UV-VIS 显色反应 无机化合物
1.显色反应的选择 显色反应: M + R MR a.灵敏度高、选择性好;b.有色化合物的组成恒定; c.显色对比度大:MRmax Rmax nm
2.显色剂 无机显色剂:利用络合反应和氧化还原反应 有机显色剂:利用配位、螯合、缔合反应 结构特点: 生色团 有 、 等共轭双键 助色团 有 、-OH等含孤对电子的基团形成有色有机化合物的类型: 配合物 螯合物 离子缔合物 二元:M—R三元:M—R—表面活性剂 多元: (增敏、增溶、增稳)
磺基水杨酸 邻二氮菲 丁二酮肟 Fe3+ =1.6 ×103 Ni2+ =1.3 ×104 Fe2+ =1.1 ×104 max =520nm max =470nm max =508nm
二苯硫腙 Pb2+ =1.3 ×104 max =520nm
10.3.2 影响显色反应的因素 吸收曲线 显色剂用量曲线 酸度曲线 温度曲线 时间曲线 工作曲线 pH
A A 10.4 吸光光度分析及误差控制 10.4.1 测量波长的选择和标准曲线的制作 1.测量波长的选择 max 无干扰,选择 有干扰
标准系列 A 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00 Ax * 未知试液 。 。 。 。 cx 0 1.0 2.0 3.0 4.0 c(mg/mL) 2.标准曲线的制作 A= b c 工作曲线法
被 测 物 M 干 扰 N 显 色 剂 R 掩 蔽 剂 L 辅助 试剂 (缓冲 液等) 化合物 参 比 溶 液 MRn NLn 内容 名称 无色 无色 无色 无色 无色 有 色 无 色 H2O NLn+R+ 缓冲液 溶剂 空白 无色 或有色 有色 或有色 无色 有 色 或 有色 NLn+R+ 缓冲液 试剂 空白 或有色 或有色 无色 或有色 无色 有 色 或 有 色 NLn+M+ 缓冲液 试液 空白 有色 有色 有色 有色 无色 有 色 有 色 NLn+M+L+R+ 缓冲液 褪色 空白 3.参比溶液的选择
10.4.2 对朗伯-比尔定律的偏离 1.非单色光引起的偏离 2.介质不均匀引起的偏离 胶体溶液、乳浊液、悬浊液 3.溶液本身化学反应引起的偏离 解离、分解
4.显色反应的干扰及其消除方法 • 控制溶液酸度 • 加入掩蔽剂 • 改变干扰离子的价态 • 选择合适的参比 • 增加显色剂的用量
10.4.3 吸光度测量的误差 A= b C dA= b dC 如何减少吸光度测量的误差?
T% 90 80 70 60 50 40 30 20 10 5 dT=1% 10.7 5.6 4.0 3.3 2.9 2.7 2.8 3.2 4.3 6.5 dT=0.5% 5.4 2.8 2.0 1.7 1.5 1.4 1.4 1.6 2.2 3.3 Er 10 8 6 A=0.2 T=65% 4 A=0.8 T=15% 2 (36.8) 20 40 60 80 T% 0 0.7 0.4 0.2 0.1 A 0.434
标准系列 未知样品 10.5 其他吸光光度法 10.5.1目视比色法
A A′ △C △Cx 10.5.2 示差光度法 普通光度法: 以空白溶液为参比 示差光度法: 以标准溶液Cs为参比 (Cx > Cs) 示差光度法的实质? 普通光度法: 示差光度法:
A X Y 2 1 单色器 光源 检测器 切光器 吸收池 狭缝 单色器 10.5.3 双波长光度分析法
10.5.4 导数分光光度法 一阶导数信号与试样浓度呈线性关系: dI/dλ=-I0bc dε/dλ 测定灵敏度依赖于摩尔吸光系数对波长的变化率dε/dλ。吸收曲线的拐点处dε/dλ最大,故其灵敏度最高(见图)。 同理可以导出其二阶和三阶导数光谱(略)
单组分的测定 10.6 吸光光度分析法的应用 微量铁的测定 邻二氮菲法 10.6.1 工业分析 氨基酸的测定 茚三酮法 蛋白质的测定 考马斯亮蓝法 10.6.2 临床分析 总磷的测定 磷钼蓝法 10.6.3 食品分析 海水中营养盐的测定
Y A X A 1 2 Cs(x) 10.6 吸光光度分析法的应用 多组分的测定 1. 解联立方程法 解联立方程,可求得Cx, Cy 2.双波长光度分析法
A HR R HR R pH 10.6.4 其它应用 1.弱酸弱碱离解常数的测定 pH (b=1cm) pH < < pKa-1 C = [HB] C = [B-] pH >> pKa+1
A n CR/CM 10.6.4 其它应用 2.络合物组成的测定 0.5 0.33 cM/c cM/c M:R=1:1 M:R=1:2 等摩尔连续变化法 饱和法(摩尔比法)
补充习题1:准确称取1.00mmol指示剂HIn5份,分别溶解于1.0升不同得缓冲液中,用1cm比色皿在650nm下测得数据如下:pH 1.00 2.00 4.70 10.0 11.00A 0.00 0.00 0.588 0.840 0.840求该指示剂的pKa。
分析方案设计 ☞Fe2++Fe3+混合液 ☞Cr(III)+ Cr(VI)混合液 显色剂? 显色条件?测定波长? 参比溶液?
例1:分析Fe2+ +Fe3+混合液中微量Fe2+和Fe3+的 含量(ug/mL) 2+ N + F e2+ 3 F e N 3 λmax = 510nm
(2) 以1号试剂空白为参比在510nm处测量2-7号吸光度A值. (3) 以1-5号标液铁含量为横坐标,吸光度为纵坐标绘制A-c标准曲线,求曲线方程与。 (4) 由曲线方程分别求出或从标准曲线上分别查出6号和7号对应的铁含量: 6号~ Fe2+; 7号~ Fe2+ +Fe3+ ; 7号-6号~ Fe3+。 (5) 将相应铁含量换算回原始试液中含量。
例2:分析Cr(III)+ Cr(VI)混合液中微量Cr(III)和 Cr(VI)的含量(ug/mL) ——二苯碳酰二阱显色法( λmax=540nm) 解:(1) Cr(III)→ Cr(VI)预处理——7号测总铬试液 酸性条件下KMnO4充分氧化Cr(III)→ Cr(VI)后,在尿素 存在下以NaNO2分解多余MnO4-。加DPCI显色剂后转移定容 至50.0mL。(氧化性: MnO4->尿素>Cr2O72-) (2) 标准系列与6号测Cr(VI)试液的配制——酸性(H2SO4)条件下直接以DPCI显色后定容至50.0mL。 (3) 工作曲线法求出6、7号分别对应的铬含量。 6号~ Cr(VI); 7号~ Cr(III)+ Cr(VI); 7号- 6号~ Cr(III) (4)将相应铬含量换算回原始试液中含量。