Enzimologia

1. Enzimologia Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

2. A vida e a energia para a vida • Duas condições fundamentais: • Autorreplicação • Metabolismo • Catálise enzimática • A queima de açúcares é a principal forma segundo a qual retiramos energia do meio ambiente para vivermos • Um saco de açúcar pode permane-cer anos na prateleira do supermercado • A prateleira não tem enzimas! • Nos animais, a glicose libera sua energia química em segundos • Reações catalíticas promovem a oxidação da glicose ao quebrar ligações químicas que armazenam energia

3. Participam das vias bioquímicas • Enzimas realizam o controle preciso do metabolismo celular • O metabolismo energético é um dos principais temas de estudo da bioquímica • Permitem resposta e adaptação a ummeio em mudança

4. O que são as enzimas? • Proteínas notáveis, altamente especializadas • Alto grau de especificidade com substratos • Poder catalítico extraordinário • Muito maior do que catalisadores sintéticos • Aceleram reações químicas • Em condições suaves de temperatura e pH • São o centro e o objeto de estudo principal da bioquímica • Atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias • Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem • Como os cientistas descobriram as enzimas?

5. Um pouco de história... LOUISPASTEUR • 1835: Berzelius, conceito de catálise • 1885: fermentação do acúcarporlêvedos, gerandoálcool • Vitalismo: o mágico élan vital • 1896: Edward Buchner conseguefermentar o açúcar num extrato de lêvedosemvida! • Fermentos, portanto, catalisavamreaçõesquímicas (açúcar a álcool) – biocatalisadores • Enzimavem do gregoενζυμη, cuja tradução é “no lêvedo” Louis Pasteur 1822-1895

6. EMILFISCHER • Sacarase • Quebradasacaroseemglicosee frutose • Produziudiversosanálogos de sacaroseparatestar se a enzimafuncionava • Determinadasmutaçõestornavamosanálogosresistentes à sacarase • Modelo de açãoenzimáticachave-e-fechadura Hermann Emil Fischer 1852-1919

8. Enzimas são proteínas? • Quala natureza das enzimas? • O químicoorgânicoalemão Richard Willstätter (1872–1942) – ganhador do Nobel pelaestruturadaclorofila – conseguiuseparar o componenteenzimático de um preparadobiológico e nãoencontrounenhumaproteína! • 1926 (EUA) – J Summer cristaliza a urease e conclui: enzimassãoproteínas! • Willstatercriticouosresultados… James Batcheller Sumner 1887-1955

9. SIM! Mas como funcionam? • Kunitz e Northrop • Eletroforese e centrifugação: enzimasestãonafraçãoprotéica! • Mesmoemquantidadesproteícasindetectáveispelosmétodos, as enzimascontinuavamtendoatividades • Como as milhares de reaçõescatalíticaserampossíveis a umaproteína? John Howard Northrop1891-1987

10. Finalmente, Sanger • 1952 • Publica a primeiraestruturaprimáriade umaproteína: a Insulina, com 51aminoácidos • O trabalhomostravatambémquea estrutura das proteínaspoderia serdescritapelasuasequência de aminoácidos, do N ao C terminal • A sequência, entretanto, nãoajudavaa prever a funçãodaproteína (antes dabioinformática) Frederick Sanger13 August 1918

11. CONCLUSÃO: HISTÓRIA DA BIOQUÍMICA • As enzimas realizam reações catalíticas e transformam moléculas umas nas outras • Os organismos biológicos são ricos em enzimas e as enzimas funcionam também fora dos organismos biológicos → biotecnologia! • As enzimas são proteínas formadas por polímeros de aminoácidos • A multiplicidade de função se dá pela interação tridimensional formada (modelo chave-fechadura) por interações não-covalentes a partir de uma série de aminoácidos ligados covalentemente (ligação peptídica) >gi|386828|gb|AAA59172.1| insulin [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKTRREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLALEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENYCN

12. Toda enzima é proteína?! • Não!, há alguns RNAsque funcionam enquanto enzimas também • Componente químico adicional necessário para a função • Cofator: íons inorgânicos • Coenzima: moléculas orgânicas complexas • Se liga muito firmemente: grupo prostético • Enzima completa: holoenzima • Parte protéica: apoenzima ou apoproteína

13. Nomenclaturase das enzimases • Normalmente se adiciona o sufixo aseao nome do substrato ou à atividade realizada • Urease – hidrolisa a uréia • DNA-polimerase – polimeriza DNA • Pepsina – pepsisvem do grego (digestão) • Sistema de classificaçãoenzimático – EC number • Quatro números: 2.7.1.1 • 2: transferase • 7: fosfotransferase • 1: transfere P para grupo OH- • 1: tem D-glicose com aceptor

14. Reação enzimática • Reação se dá em fases: • Enzima aumenta a velocidade das reações • Os catalisadores aumentam a velocidade das reações por que diminuem a energia de ativação

15. Equilíbrio químico • As enzimas realizam, muitas vezes, as reações nos dois sentidos • A concentração de substratos e produtos é o que define a velocidade das reações • Poder catalítico das enzimas vem da energia livre liberada na formação de ligações fracas quando da interação enzima-substrato • Interações fracas entre ES são otimizadas no estado de transição

16. Bastonase • Pauling (1946): Enzima deve ser complementar ao Estado de transição (ET), não ao substrato • ET não é forma estável • Interações fracas entre a enzima e o substrato propulsionam a catálise enzimática • Necessidade de múltiplas interações fracas explica pq alguns prots são tão grandes Estabiliza o substrato

17. Especificidade enzimática • Deriva da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico • Redução da entropia pela ligação • Dessolvatação do substrato • Ajuste induzido, proteína tbm muda de conformação

18. Grupos catalíticos • Catálise geral ácido-base • Transferência de prótons • Catálise covalente • Formação de lig. covalentetransitória entre E e S • Ativação do substrato • Catálise por íons metálicos • Estabilizam estados de transição • 1/3 das enzimas conhecidas usam íons metálicos nas reações catalíticas • Enzimas muitas vezes usam as três estratégias de catálise em conjunto -- quimiotripsina

19. Cinética enzimática • Experimentos de mutagênesesítio-dirigidapermite que os pesquisadores investiguem o papel de cada aminoácido na função protéica • A concentração do substrato [S] influi na velocidade das reações catalisadas por enzimas • Velocidade máxima é abstraída para concentrações excessivas de Substrato • Constante de Michaelis • kM = [S] correspondente a ½ Vmax;

20. Reações com 2 ou mais substratos • Enzimas podem formar os chamados complexos ternários ou realizar as reações uma-depois-da-outra • Velocidade das reações químicas depende também da faixa de pH • Maior velocidade está normalmente associada ao pH do ambiente onde a enzima atua

21. Inibição reversível • Inibição competitiva • Inibidor compete pela ligação ao sítio ativo • A ligação do inibidor altera os parâmetros cinéticos, tornando a reação mais lenta • Os inibidores irreversíveis ligam-se covalentemente ou destroem grupos funcionais da enzima • Podem ser usados como drogas

22. Exemplos de reações enzimáticas • Quimiotripsina • Lisozima • Hexocinase • Enolase • Beta-lactamases • Proteases do HIV

23. A quimiotripsina • Catalisa a hidrólise de ligações peptídicas adjacentes a aminoácidos aromáticos (Trp, Phe, Tyr) • Forma intermediário acil-enzima covalente

25. A hexocinase • Sofre um ajuste induzido quando ligada ao substrato • Fosforila um resíduo de glicose • Primeiro passo da via glicolítica • Adição de Xilose “engana” a enzima e faz com que ela fosforile a água

26. A enolase • Realiza desidratação reversível de 2-fosfoglicertato a fosfoenolpiruvato • Dímero com 436aa • Catálise geral ácido base + estabilização do estado de transição • Interações estabilizam intermediário (enolato) • Ligações de H com outros aa’s do sítio ativo contribuem para o mecanismo geral

27. A lisozima • Agente antibacteriano natural encontrado nas lágrimas e clara de ovo • Peptideoglicano da parede de bactérias é seu substrato • Constituinte da parede microbiana que protege da lise osmótica • Enzima rompe ligação glicosídica • Monômero com 129 aa’s • Mecanismo específico de ação enzimática ainda é controverso “mesmo uma infinidade de experimentos não pode provar que algo esteja certo, mas um único experimento pode provar que está errado”. Albert Einstein

28. Medicamentos • Muitos são inibidores de enzimas são usados para tratar doenças; desde as dores de cabeça até a AIDS • Penicilina (Alexander Fleming, 1928) • Peptideoglicano: polímero de açúcares e D-aa’s da parede bacteriana • Penicilina interfere na síntese do peptideoglicano ao mimetizar um segmento D-Ala-D-Ala • Inibem reação de transpeptidase

29. Os Beta-lactâmicos • Penicilina: degradada no ambiente do estômago • Penicilina V: estável em meio ácido pode ser administrada em via oral • Amoxilina: ampla faixa de ação; antibiótico β-lactâmico + prescrito • O ataque da Ser à porção amida do anel leva a um produto acil-enzima que é praticamente irreversível • Transpeptidaseinativa! • Bloqueia síntese da parede bacteriana • Rompe-se devido à pressão osmótica

30. As Beta-lactamases • Enzimas que quebram o anel beta-lactâmico das penicilinas • Disseminaram-se em bactérias submetidas à pressão seletiva • O mau uso dos antibióticos

31. Guerra contra as bactérias • Acido clavulânico: inativa irreversivelmente as Beta-lactamases • Clavulin: amoxilina + ácido clavulânico • Foram encontradas bactérias resistentes ao ácido clavulânico... • Desenvolvimento e descoberta de novos antibióticos é uma indústria em crescimento

32. Os antivirais: (1) o que é um vírus? • Anatomia molecular viral • Ácido nucléico envolto por uma capa protetora feita de proteínas (capsídeo) • Uma única molécula de ácido nucléico de fita simples ou dupla (fita positiva ou negativa) • Genomas compactos • Contêm apenas as proteínas necessárias à replicação viral • Genomas da ordem de Kb

33. Parasitismo intra-celular • O vírus não tem metabolismo próprio • Não é um organismo de vida-livre • Parasita intra-celular obrigatório • Forma de cristal • Sequestra a maquinaria molecular da célula • Mecanismo moleculares de produção preferencial dos genes virais (fator sigma próprio e específico)

34. Variedades virais • Vírus de DNA • Precisam chegar ao núcleo para serem primeiramente transcritos em RNA • Vírus de RNA • Podem atuar no citoplasma • Vírus de RNA com transcrição reversa • Acontece a transcrição reversa do RNA em DNA e o DNA é normalmente integrado ao genoma do hospedeiro

35. HIV • SIDA: Síndrome da imunodeficiência humana • Pandemia • Matou 25 milhões de pessoas nos últimos 25 anos • Retrovírus (lentivirus) • 2 cópias de um RNA fita simples (fita +) • Nove genes • Capsídeo é formado por cerca de 2000 proteínas p24 • 0,6% da população humana está infectada

36. AZT (azidotimidina) • Mimetiza um nucleotídeo de timina • Azida no lugar de hidroxila • Prejudica a ação da transcriptase reversa • Atrasa o desenvolvimento dos vírus, ainda que, aos poucos o vírus se torne resistente Transcriptase reversa mutante passa a não reconhecer mais o AZT

37. Outros tratamentos • Inibidores de protease • Impedem a protease do HIV de clivar as proteínas produzindo componentes maduros • Inibidores de integrase • Impedem o vírus de integrar seu DNA no genoma do hospedeiro • Inibidores de fusão • Interferem nas proteínas gp120 e gp41 ou bloqueiam receptores celulares de ligação ao HIV • Coquetel anti-AIDS • dificulta a adaptação do vírus a várias frentes moleculares de ataque, diminui comprovadamente o número de vírus no sangue

38. Proteases do HIV • O RNA do vírus é traduzido em grandes proteínas • Essas proteínas precisam ser hidrolisadas em proteínas individuais do capsídeo • A protease do HIV é uma aspartil-protease • 2 resíduos de Asp facilitam ataque da água à ligação peptídica

39. Inibidores de proteases • Drogas que formam complexos não-covalentes com a protease do HIV • Ligam-se fortemente: praticamente irreversíveis • Cadeia principal com grupo hidroxil próximo a grupo benzil • Grupo hidroxil mimetiza a água • Resto da estrutura encaixa nas fendas da enzima • Estrutura planejada para ser análoga ao estado de transição • Sucesso terapêutico • Aumentou longevidade e qualidade de vida dos doentes

40. Enzimas regulatórias • Possui atividade catalítica aumentada ou diminuída em resposta a certos sinais • Ajustes na velocidade da via metabólica permite que as células se adaptem a condições em variação • Tipos mais comuns • Enzimas alostéricas (ligações reversíveis a compostos) • Modificações covalentes • Ativadas por remoção de segmentos peptídicos (irreversível) • Subunidade regulatória é normalmente diferente da subunidade catalítica

41. Enzimas alostéricas • Homotrópicas: o ativador é o próprio substrato (hemoglobina) • Heterotrópicas: outro ativador • Enzimas alostéricas • Mais de um sítio regulatório • Cada um específico para um regulador • Aspartato-transcarbamoilase • 12 cadeias polipeptídicas • Azul: catalíticas • Vermelho/Amarelo: regulatórias

42. Enzimas alostéricas são reguladoras • ... de vias bioquímicas • Normalmente são o primeiro passo da via • “economiza” a execução das outras reações • Único passo de regulação da via • Inibição por retroalimentação: São inibidas pelo produto do último passo • Inibição alostérica heterotrópica

43. Regulação por modificações covalentes • 500 tipos diferentes Modificações pós-traducionais covalentes já foram descritos • Proteínas inteiras podem ser adicionados como a ubiquitina e a sumo • Ubiquitinilação marca proteína para degradação • Sumoilação é encontrada em proteínas nucleares • Mudanças substanciais afetam de forma significativa a função da enzima • Fosforilação é a mudança mais comum • Podem haver vários sítios fosforiláveis

44. Proteínas cinases e fosfatases • Cinases: adicionam grupo fosforil a resíduos de Ser, Throu Tyr • Básicas: fosforilam resíduos de vizinhança básica • Preferências por resíduos próximos a Pro • Atómos de O2 do grupo fosforil podem fazer pontes de H com outras regiões da proteína • Reestabiliza a proteína estruturalmente • Atuam em cascatas de sinalização celular

45. Cinases sítio-específicas • Fosforilações são sítio-específicas • Cada enzima reconhece uma ordem de aminoácidos e fosforila resíduos de S, T ou Y • Sítio de reconhecimento • Sítio de fosforilação

46. Fosforilações múltiplas • São possíveis e permitem controle requintado da regulação • Glicogênio sintase • Catalisa a união de glicoses para formar glicogênio • Fosforila em vários sítios (ver figura)

47. Proteólise de precursores • Proteases não podem ser produzidas em estado ativo • Do contrário destruiriam as proteínas celulares... • Zimogênios são precursores das proteínases • Só funcionam depois da ativação por proteínas • Ativação irreversível • Mecanismo de produção de pró-proteínas ou pró-enzimas

48. Conclusões • A atividade das vias metabólicas é regulada pelo controle da atividade de certas enzimas • O conhecimento do mecanismo de ação das enzimas permite desenvolver medicamentos que inibam essa ação • A inibição de uma enzima pode ser reversível, competitiva • Os principais mecanismos de catálise são: ácido-básica, covalente e por íons metálicos • As enzimas são catalisadores eficazes, aumentando a velocidade de ocorrência de uma reação

49. Aula baseadano livro do Lehninger(Nelson e Cox) • Capítulo 6 Enzimas