FUNGAL ENZİMLER

1. FUNGAL ENZİMLER Yrd.Doç.Dr. Numan YILDIRIM Tunceli Üniversitesi Mühendislik Fakültesi Çevre Mühendisliği Bölümü

2. Canlıların sınıflandırılması ve Fungusların sistematikteki yeri

3. Bu iki fotoğraftaki aynı şey nedir. Fungus.

4. Hif:Misel:

5. Fungal hif yapıları

6. Mikorizal ilişki • “myco” = fungus ve “rhiza” = kök • Funfuslarla bitki kökleri arasındaki simbiyotik ilişki • Ektomikoriza ve endomiloriza gibi farklı iki tipi mevcuttur

7. Mikorizal ilişkinin yararı • Fungus bitki kökleri için gerekli olan su ve besin varlığını arttırır. • Ekosistemdeki stabilitesini arttırır • Bitkinin verimliliğini arttırır. sol: Mikorizal fungus bulundurmayan sağ: Mikorizal fungus bulunduran

8. Odun bileşenleri parçalanmayınca ne meydana gelir?

9. Funguslar önemli parçalayıcılardır Funguslar lignini en etkin bir şekilde parçalayan tek mikroorganizmalardır. Funguslar lignin, selüloz ve hemiselülozu parçalayarak global karbon döngüsüne büyük katkıda bulunur.

10. Funguslar tarafından üretilen penisilin bakteri hücre duvar sentezini inhibe ederek patojen bakterilerin ortadan kaldırılmasında kullanılır.

17. Enzimler protein yapısında olduklarından ortamın sıcaklığından etkilenirler. 0 0Cta enzimler çalışmaz, aktif değildir. Enzimlerin en iyi çalıştığı sıcaklık vücut sıcaklığıdır. ( 30-37 0C ) Optimum sıcaklıktan sonraki artışlar hızı yavaşlatır. 55 0C tan sonrada enzim çalışması durur. Yüksek sıcaklıkta enzimin yapısı bozulurken, düşük sıcaklıkta bozulmaz.

18. Enzimler genellikle nötr pH’da (pH=7) çalışırlar. Ancak her enzimin kendine özel bir pH aralığı vardır. Örneğin: Sindirim sisteminde, ağızda işgören enzimler nötr (pH=7), midedekiler asidik (pH=2), bağırsaktakiler bazik (pH=8.5) ortamda çalışırlar.

19. Tepkime Hızı Enzim Yoğunluğu Ortamda yeterli substrat varsa, enzim miktarı arttıkça tepkime hızı da artar.

20. Tepkime Hızı Substrat yoğunluğu 4. Substrat Yoğunluğu : Ortamda enzim miktarı sabit ise substrat eklendikçe tepkime hızı da bir süre artar daha sonra sabitleşir. Çünkü hızın maximum olduğu noktada tüm enzimler substrata doymuş ve çalışıyor durumdadır.

21. Tepkime Hızı Substrat yüzeyi 5. Substrat Yüzeyi : Enzimler etkiye substratın dış yüzeyinden başladığı için, substrat yüzeyi ne kadar geniş olursa tepkime hızı o kadar artar. Bundan dolayı, ağızda iyice çiğnenen besinlerin sindirimi daha kolay gerçekleşir.

22. 6. Su : Enzimler sulu ortamda çalışırlar. Enzimlerin çalışması en az %15 sulu ortamda gerçekleşir. Tohumların içindeki nem miktarı %5 olduğu için kuru ortamlarda çimlenme gerçekleşemez.

23. Reaksiyon Hızı Enzim + Aktivatör Enzim Enzim + İnhibitör Zaman 7. Aktivatör Maddeler : Enzimlerin çalışmasını hızlandıran maddelerdir. Vitaminler ve bazı mineraller bu şekildedir. 8. İnhibitör Maddeler : Enzimlerin çalışmasını durduran, engelleyen, azaltan maddelerdir. Bazı antibiyotikler, civa, kurşun, siyanür gibi zehirler.

25. Beyaz Çürükçül Funguslar Beyaz çürükçül funguslar;Basidiomycetes sınıfına dahil olup, odunun bileşenlerini parçalar ve odunda beyaz renkli bir kalıntı oluşmasına neden olurlar.Doğal şartlar altındaölü yada canlı odun üzerinde lignini etkin bir şekilde yıktığı ifade edilen canlıların sadece beyaz çürükçül funguslar olduğu rapor edilmiştir. Beyaz çürükçül fungusların, odunda bulunan protein ve karbonhidratlardaki azot ve karbon kaynaklarına daha kolay erişebilmek için lignini yıktıkları ifade edilmiştir.

26. Lignolitik Enzim Sitemleri Lignin yıkımının, lignolitik enzimlerin birlikte hareketiyle gerçekleştirildiği düşünülmektedir. Liginin yıkımına katılan ana ekstraselüler enzimler, hem gurubu içeren lignin peroksidaz (Ligninaz, Lip, E.C 1.11.1.14), mangan peroksidaz (MnP, E.C 1.11.1.13) ve bakır içeren lakkaz(benzenediol:oksijen oksidoredüktaz, E.C 1.10.3.2)’dır. Lignin yıkan enzimler, ligninin aromatik yapıları üzerinde farklı oksidatif reaksiyonlara katılan, substrat spesifitesi geniş olan enzimler olarak bilinmektedirler. Yıkım sonrası oluşan düşük moleküler ağırlıklı bileşikler, daha ileriki hücresel solunuma katılmaları için hücre içerisine kolayca taşınabilmektedir.

27. Fungal Enzimler • Lakkaz • Mangan Peroksidaz (MnP) • Lignin Peroksidaz (LİP) • Selülaz • Ksilenaz • Amilaz • Proteaz • Lipaz

28. Lakkaz (Benzenediol:oksijen oksidoredüktaz) E.C 1.10.3.2 Lakkaz; Çoklu bakır fenoloksidazdır, fenolik bileşikleri fenoksil radikallerine oksitlerler, ABTS (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonic acid) veya 1-hydroxybenzotriazole gibi mediatörlerin varlığında fenolik olmayan bileşikleri de oksitleme yeteneğindedir. Lakkaz ilk olarak bitkilerden izole edilmiştir. Ancak bazı bakteri ve funguslarda da mevcuttur. Bitkilerdeki lakkazlar polimerizasyon reaksiyonlarında ligninin şekillenmesine katılırlar, fungal lakkaz ise lignin yıkımı, sporulasyon, pigment üretimi, şapka oluşumu ve bitki patojenezisi gibi süreçlere katkıda bulunurlar. Bakteriyel lakkazların melanin üretimine ve spor ceketin dirençliliğine katkıda bulunduğu ifade edilmiştir.

29. Lakkaz (Benzenediol:oksijen oksidoredüktaz) E.C 1.10.3.2 Lakkazlar tipik olarak 3 farklı tipte 4 bakır atomu içerir. Farklı bakır domainlerinin varlığı lakkazın katalitik aktivitesi için oldukça önemlidir. Birincil elektron alıcı olarak görev alan Tip-1 bakır, 2 histidin ve bir sisteine bağlıdır. Tip-1 bakır elektronları redükleyici fenolik substrattan alır ve bu elektronları Tip-2 ve Tip-3 bakır bölgelerindeki trinükleer merkeze taşır. Trinükleer merkez 8 histidin kısımlarıyla düzenlenmiştir ve moleküler oksijenin bağlanma bölgesidir. Oksijen atomu suya redüklenmek için Tip-1 bakırdan elektronları alır.

30. Lakkaz (Benzenediol:oksijen oksidoredüktaz) E.C 1.10.3.2 Lakkaz, Lignin peroksidaz ve mangan peroksidaz gibi diğer lignolitik fungal enzimlerle birlikte işlev görerek lignini oksitler. Lakkaz fenolik bileşiklerin fenolik hidroksil guruplarını O2 ile fenoksi radikallerine oksitleyen bir enzimdir. Bu gerçekleşen reaksiyon esnasında O2 suya redüklenir, oluşan fenoksi radikalleri ise enzimatik olmayan bir reaksiyon ile ligninin yıkımını gerçekleştirir.

31. LAKKAZIN TEKSTiLDE KULLANIM ALANLARI • Lakkaz, tekstil sanayinde tekstil atık sularının renksizlestirilmesinin yanı sıra tekstillerin ağartılmasında, kaynatılmasında, denim yıkamada ve hatta boyarmaddelerin sentezinde de kullanılmaktadır • Novozyme (Novo Nordisk, Danimarka) 1996’da denim terbiyesinde lakkaz enziminin endustriyel uygulamasını baslatmıstır.

32. Lakkazlar, selulozik liflerde bulunan yağlar, mumlar, pektinler, proteinler ve pigmentler gibi doğal renklendirici maddelerin uzaklastırılması ve bu sayede boyama, baskı ve bitim gibi islemlere hazırlanması amacıyla kullanılmaktadır. • Kaynatma islemleri, cesitli kimyasal maddelerle yapılmakta ve cevresel acıdan kirlilik olusturmaktadır. Bu nedenle daha ekolojik bir proses olan enzimatik kaynatma tercih edilmektedir. Enzimatik kaynatma islemlerinde daha cok pektinaz kullanılmakta olup ksilanaz, proteaz, lakkaz, lipaz ve selulaz gibi enzimlerle de denemeler yapılmıstır.

33. Lakkaz Tekstil Atık Sularının Biyolojik Parcalanması ve Renksizlestirilmesinde Kullanımı • Azo, trifenil metan ve ftalosiyanin gibi farklı kromofor grupların varlığı, boyarmaddelerin yapısal cesitliliğini sağlamaktadır. Gorsel etki ve kimyasal oksijen ihtiyacı (COD) acısından yan etkilerinin yanı sıra coğu sentetik boyarmaddeler, toksik, kanserojen ve genotoksik etkiler de gostermektedir. Mevcut atık su sistemleri ise, bu tip atıklardan inatcı boyarmaddeleri ve diğer organik kalıntıları tamamen uzaklastırmakta yetersiz kalmaktadırlar

34. Lignin Peroksidaz (Ligninaz, Lip) E.C 1.11.1.14 ) • LiP, 38-47 kDa moleküler ağırlığa ve asidik izoelektrik noktaya sahip, N-glikozlanmış bir glikoprotein yapıda hücre dışı enzimdir. LiP, oksidatif lignin depolimerizasyonunu elektron transferiyle gerçekleştirebilen hidrojen peroksit bağımlı bir peroksidazdır. Aktif bölgesinde tekli ferik protoporfirin hem gurubu bulunan ve klasik peroksidazlar gibi çalışan bir peroksidazdır. LiP ayrıca fenol içermeyen, elektron yönünden zengin aromatik lignin modelli bileşiklerinde oksidasyonunu katalizleyebilmektedir Lignin peroksidaz ilk kez, Phanerochaete chrysosporium’un azotça sınırlanmış besi yerimde üretilmesi neticesinde bu fungusun ekstraselüler ortamında keşfedilmiştir.

35. Lignin Peroksidaz (Ligninaz,Lip) E.C 1.11.1.14 ) • Lignin peroksidazlar, yaklaşık moleküler ağırlıkları 40 kDa olan monomerik hemoproteinlerdir. LiP’ler ve klasik peroksidazlar arasındaki en önemli farklılık LiP’lerin elektron sağlayan bileşiklerin varlığında aromatik halkaları oksitleyebilmesidir. Buna karşın klasik peroksidazlar sadece güçlü bir şekilde aktive edilmiş aromatik substratlar üzerinde etki gösterebilirler

36. Lignin Peroksidaz (Ligninaz, Lip) E.C 1.11.1.14 ) • Lip’lerin sahip olduğu temel iki özellik onların bu sıra dışı aktivitelerini sağlamaktadır. Birincisi, porfirin halkadaki demirin klasik peroksidazlarınkinden daha elektro-defficient oluşudur ki bu durum LiP’i oldukça güçlü bir oksidan yapar. İkincisi, bir izoenzim LiPA’da bulunan bir triptofan residüsü olan trp-171 enzim yüzeyinde yerleşmiş durumdadır. Bu ikinci özellik LiP’in lignin benzeri substratları oksitlemesini mümkün kılar. Lignin yıkan peroksidazlar, iki alt domaine sahip, 11-12 α heliksten oluşmuş globular proteinlerdir

37. Lignonlitik Peroksidazların Genel Moleküler Yapısı (Martinez, 2002)

38. Mangan Peroksidaz (MnP) EC. 1.11.1.13 • Neredeyse tüm beyaz çürükçül funguslar tarafından en yaygın şekilde üretilen lignolitik peroksidaz, mangan peroksidazdır. Bunlar demir (Fe) içeren hem prostetik gurubu bulunduran ve şeker gurupları içeren glikoproteinlerdir. Mangan peroksidaz yaklaşık olarak 20 yıl kadar önce ilk olarak Phanerochaete chrysosporium’da keşfedilmiştir. Mangan peroksidazın üretimi belli Basidiomycete sınıfı Funguslarla sınırlıdır ve şimdiye kadar hiçbir bakteri, maya ve küf tarafından üretildiği tespit edilmemiştir. Mangan peroksidaz Mn2+ iyonunu Mn3+ iyonuna H2O2 bağımlı bir şekilde oksitleyerek fenolik yapıdaki lignin ve benzeri diğer yapıları1 e- kopararak onları özgün olmayan şekilde oksitler.

39. Mangan Peroksidaz (MnP) EC. 1.11.1.13 • Mangan peroksidazın molekül ağırlığı 32-62.5 kDa aralığında olmakla birlikte bir çok saflaştırılan MnP’nin moleküler ağırlığının yaklaşık 45 kDa olduğu görülmüştür. MnP’ler çoğunlukla bir çok izoform şeklinde üretilir ve bu izoformlar farklı izoelektrik noktalara sahiptirler (pI 3-4) Mangan peroksidaz, indirgen substratı ile kompleks oluşturması için Mn+2’yi tercih eden bir enzimdir. Şelat oluşturmuş Mn+3 düşük moleküler ağırlıklı oldukça reaktif, difüze olabilen bir redoks mediatörü olarak davranır. Oluşan Mn+3’ü stabil hale getirmek için fungus tarafından üretilen bir organik şelatör olan dicarboxylic acid gereklidir.

40. Mangan Peroksidaz (MnP) EC. 1.11.1.13 • Mn+3 tarafından gerçekleştirilen oksidatif reaksiyon, çeşitli fenolik substratlardan, karboksilik asitlerden ve doymamış yağlardan radikaller oluşmasına neden olur. Bu durum sonrası ligninin fenolik yapılarında fenoksi radikal ara ürünleri oluşur. Oluşan bu radikaller demethoxylation, quinon oluşumu ve Cα-Cβ kırılması gibi çeşitli olaylar gerçekleşir. MnP, gerçekleşebilecek olan lipid tabanlı peroksidasyon reaksiyonları sonrası çok daha rekalsitrant özellikteki fenolik olmayan yapılarıda oksitleyebilir. Şelatlayıcı organik asit ve doymamış yağların varlığında fungal MnPler in vitro şartlarda sentetik lignini mineralize edebilirler

41. Mangan Peroksidaz (MnP) EC. 1.11.1.13 Mangan Peroksidazın Katalitik Döngüsü (Hofrichter, 2002)

42. Mangan Peroksidaz (MnP) EC. 1.11.1.13 • MnP tekstil boyaları gibi yıkımı güç ksenobiyotikler ile doğal substratı olan lignini depolimerize ve okside edebilir. Lignin peroksidaz tarafından kullanılan indirgen substrat türleri mangan peroksidazın substratından biraz farklılık gösterir. Lignin peroksidaz için bir bileşiğin substrat olup olmadığını belirlemede iki faktör önemlidir.; birincisi molekülün büyüklüğü ikincisi de redoks potansiyelidir. Lignin peroksidazın diğer peroksidazlardan daha yüksek redoks potansiyeline sahip olması bu enzimi poliaromatik hidrokarbonlar için (PAH) iyi bir yükseltgen yapar. Lignin peroksidazda indirgen substratın bağlanma bölgesi tam olarak doğrulanmamış olması lignin gibi büyük moleküllerle lignin peroksidazın kinetik parametrelerini belirlemenin oldukça zor olmasına sebep olur