Proizvodnja organskih kiselina

1. Proizvodnja organskih kiselina Izv. prof. dr. sc. Jasna Mrvčić

2. Proizvodnja organskih kiselina • Anaerobna razgradnja šećera (mliječna, propionska) • Nepotpuna oksidacija šećera (limunska, glukonska) • Oksidacija etanola (octena) Primjena • Prehrambena industrija (octena E260, mliječna E270, propionska E280, limunska E330, glukonska E574) • Sirovina pri proizvodnji biorazgradivih plastičnih masa (PLA- mliječna) • Farmaceutska industrija (dteregenti, sredstva za čišćenje...)

3. Mikrobna proizvodnja octa* * Ocat je začin proizveden dvostrukim mikrobnim postupkom iz šećernih ili škrobnih sirovina, a sadrži specificiranu količinu octene kiseline

4. Industrijska proizvodnja octa: • Mikrobnom oksidacijom etanola – prehrambena industrija • Suhom destilacijom drveta (štetni sastojci – mravlja k., metanol) • - zabrana u prehrambenoj industriji • Katalitičkom sintezom proizvoda iz nafte i plina (butan, eten, etanol..) • - skupa oprema • Dvostruki mikrobni postupak: EtOH + O2 Fermentacija Oksidacija

5. ...iz povijesti • prvi pisani zapis o octu - Babilonsko carstvo - 5000 godina pr. Kr. • paralelno s proizvodnjom vina i piva – njihovim kvarenjem • 14. st. – proizvodnja “Orleanskim” postupkom • 19. st. Pasteur opisuje bakterije octene kis. • Oko 1930. započinje proizvodnja u Fringsovim generatorima, a kasnije i u Fringsovim acetatorima • Antibiotičko razdoblje – razvoj procesa i opreme u biotehnološkim • procesima – SUBMERZNI POSTUPCI • Danas – submerzni postupci proizvodnje s različitim izvedbama dobave kisika • zapisi i o njegovom ljekovitom djelovanju – ljek protiv kuge, pročišćavanje i jačanje organizma, mršavljenje, nesanice, nervoze - znanstveni dokazi ???

6. VRSTE OCTA ) Specijalne vrste: aceto balsamico, sherry ocat

7. Biotehnološki postupak proizvodnje octa

8. 1. Radni mikroorganizam – bakterije octene kiseline (AAB) AAB iz proizvodnje vina, piva i kvasca – bakterije kvarenja, proizvode male količine octene kiseline (A. orleanensis, A. oxydans, A. pasteurianus) AAB brze proizvodnje octa – brzo proizvode octenu kiselinu uz visoke prinose

9. Bakterije octene kiseline (AAB) Obitelj Acetobacteraceae: Rodovi: • Acetobacter • Gluconobacter • Gluconoacetobacter • Acidomonas Industrijska mikrobna proizvodnja octa: vrste iz rodova Acetobacter i Gluconobacter • - A. aceti, G. europeus; A. pasterianus, A. polyoxogenes, G. xylinus.. • obligatni aerobi • Gram negativne do Gram-promjenjive • štapičaste, elipsoidne, pojedinačne, parovi ili lanci • nesporogene • oksidacija alkohola u octenu kiselinu; oksidacija octene kiseline do • ugljičnog dioksida i vode - Sistematika i taksonomija AAB nije dovršena i stoga se često mijenja

10. Mehanizam oksidacije etanola i glukoze u metabolizmu bakterija octene kiseline

11. Odlike proizvodnih vrsta: • Lako rastu i brzo se razmnožavaju u podlozi za pr.octa (otopina etanola u vodi, produkt octena kis !!!) • Podnose niske pH vrijednosti podloge • Brzo proizvode octenu kiselinu uz visoke prinose • Nemaju izraženu sposobnost oksidacije octene kiseline do CO2 • Priprema inokuluma i/ili inokulacija bioreaktora: • razvojem laboratorijski čiste kulture • inokulacijom bioreaktora MATIČNIM OCTOM – nefiltrirani sirovi ocat uskladišten u ležeće spremnike, sadrži mali broj živih stanica na površini tekućine u spremniku

12. 2. Hranjive podloge za proizvodnju (bijelog, alkoholnog) octa Kisik je supstrat za aerobne mikrobne procese: Potreba na kisiku ovisi o količini etanola, starosti i vrsti bakterije i količini octene kiseline (oksidacija do CO i HO). (KLa = volumni koeficijent brzine prijenosa kisika) * Standardna podloga na početku polukontinuiranog uzgoja ima oko 4-5% vol/vol etanola te 5-7% octene kiseline Podloga za nadopunjavanje - 10-15% vol/vol etanola Podloga za pritok – 50-60% vol/vol etanola

13. Hranjive podloge za proizvodnju vinskog octa i octa iz voćnih vina Vina s niskom koncentracijom alkohola (7-9 vol%) Vina u kojima je započelo kvarenje AAB Predobrada vina – odsumporavanje Dodatak octene kiseline i hranjiva (??) Nutrients

14. Bioproces Optimalni uvjeti uzgoja: T = 25-30oC (hlapivost etanola i octene kiseline) pH = 4-6 Visoka koncentracija otopljenog kisika Tehnike uzgoja: površinski i submerzno Prirodno zaštićen proces (etanol, octena kiselina !!!) 2CH3CH2OH + O2→ 2CH3COOH + H2O M = 46 M = 60 YP/S teorijski = 1,3 kg octene kiseline/1 kg EtOH 1,3 kg octene kiseline/1,3 L EtOH 1% (masa/vol) OK------1% (vol/vol) EtOH

15. Proizvodnja octa Površinski Submerzno Proizvodnja u acetatoru Orleanski postupak Proizvodnja u Fringsovom generatoru Bioproces Zbog izrazito oksidativnog metabolizma - brza proizvodnja submerzno u acetatorima (visoki Kla, mješala samousisnog tipa, turbinska mješala) Površinski procesi – sporiji, ocat bolje arome zbog tvorbe estera

16. Proizvodnja u acetatoru Automatizirani bioreaktor opremljen samousisnim mješalom, mjeračem EtOH, temperature... Proizvodnja polukontinuiranim procesom (pražnjenje 1/3-1/2 Vol), 1-2 dana Pražnjenje reatora – vrlo brzo kako konc. EtOH ne bi pala ispod kritične vrijednosti (“tehnološki minimum”, 0,5%), oksidacija octene kiseline do CO2, inepovratna oksidacija etanola Punjenje reaktora – oprezno, zbog osjetljivosti AAB na kolebanja temperature Oksidacija – egzoterman proces - hlađenje

17. Bioproces – postupak vođenja submerznih procesa • Ovisi o željnoj koncentraciji octa na kraju procesa: • Ocat standardne koncentracije: polukontinuirano • Ocat povišene koncentracije: polukontinuirano s pritokom supstrata Standardna podloga na početku polukontinuiranog uzgoja ima oko 4-5% vol/vol etanola te 5-7% octene kiseline Podloga za nadopunjavanje - 10-15% vol/vol etanola Podloga za pritok – 50-60% vol/vol etanola

18. Bioproces – postupak vođenja submerznih procesa • Ovisi o željnoj koncentraciji octa na kraju procesa: • Visoko koncentrirani ocat: dvostupanjski uzgoj u dva bioreaktora, pri čemu prvi radi polukontinirano s pritokom supstrata, a drugi šaržno s pritokom supstrata

19. Prednosti submerznog postupka proizvodnje octa u acetatoru • visoko iskorištenje, 90-95% od teorijskog • jednostavan prijelaz s jedne sirovine na drugu, jer se ne koristi imobilizirana biomasa • lagano pokretanje i zaustavljanje procesa • velika ušteda prostora • jednostavno upravljanje proizvodnjom (automatizacija) • korištenje sirovina s niskim sadržajem etanola • dobra kvaliteta octa

20. Proizvodnja u Fringsovom generatoru(površinska tehnika) Reaktor od tikovog ili hrastovog drva, biomasa imobilizirana na strugotinama (filtracija!) Izrazito aromatičan ocat – glavni razlog zadržavanja ovog načina proizvodnje Dugotrajan proces, težak prelazak s jednog tipa proizvoda na drugi Zbog sporosti procesa ocat dozrijeva paralelno s oksidacijom etanola

21. Orleanski postupak proizvodnje octa Tradicionalni način proizvodnje vinskog octa Bioproces – spontana oksidacija etanola na površini tekućine, u drvenim bačvama volumena 200 L Polukontinuirani proces, pražnjenje nakon 4-5 tjedana Ocat izražene arome

22. 3. Izdvajanje i pročišćavanje proizvoda Faze: Bistrenje, Odležavanje, Filtracija ili Pasterizacija, Punjenje i skladištenje Bistrenje “sirovog” octa: Neke vrste AAB imaju mogućnost flokulacije i samotaloženja – sporo Sredstva za bistrenje: bentonit, silikagel, albumini Bistrenje: u posudama za bistrenje 1-2 dana – alkoholni ocat 3-5 dana – vinski i voćni ocat nakon bistrenja sirovi ocat se dekantiranjem odvoji od taloga Odležavanje i dozrijevanje: Sirovi ocat – oštar, neugodan okus i miris koji potječe od acetaldehida Tijekom dozrijevanja – troši se zaostali etanol, te se sav acetaldehid oksidira u octenu kiselinu – gubitak oštrog okusa, tvorba estera – aroma octa Odležavanje – bijeli ocat: 2-7 dana; vinski i voćni: nekoliko tjedana ili mjeseci Problem!!! Zaostale AAC oksidiraju ocat do CO2 – posude za odležavanje nadopunjene do vrha, te nadopunjavanje zrelim octom kako bi se onemogućio pristup O2

23. Filtracija ili pasterizacija: Filtracija – naplavni (dijatomejska zemlja, celulozna vlakna) ili membranski filteri (membrane propusne za spojeve male M – ocat, EtOH,H2O) - uklanjaju se zaostale stanice AAB i njihovi autolizati - sprečava se sekundarni rast AAB u ambalažiranom proizvodu Pasterizacija – termička obrada octa, uklanjanje zaostalih AAB Prije punjenja - u izmjenjivačima topline Nakon punjenja - u tunelskim pasterizatorima prolaskom boca napunjenih octom

24. Proizvodnja balzamskog octa (Aceto balsamico) Tradicionalna ili industrijska proizvodnja TRADICIONALNO (10 - 25. godina) 1. Kuhanje mošta (bijelog ili crnog grožđa) na ½ volumena (30% šećera) 2. Simultana fermentacija i oksidacija u drvenim bačvama Drvene bačve – količina kisika optimalna za alkoholnu fermentaciju i oksidaciju Hrastovina – najtvrđe drvo, najmanja dobava kisika (prva i zadnja bačva) Smreka – meko drvo, najveća difuzija kisika – oksidacija EtOH do octene kis. INDUSTRIJSKI – uobičajenim tehnološkim postupcima u generatoru ili acetatoru iz ugušćenog mošta ili ugušćenog voćnog soka, uz obavezno odležavanje Znatno siromašniji okus i miris od tradicionalno proizvedenog octa Tamno-crvene boje – antocijani i tanini vina i drveta, sirupast – šećera, ekstrakti drveta

25. Aromatizirani ocat - primjeri Dodatak aroma-prema pravilniko o prehrambenim aditivima Mediteran - vinski bijeli ocat uz dodatak svježeg začinskog bilja ružmarina i timijana, uz odležavanje Barrique - aromatični vinski ocat, odležao u hrastovim bačvama, s karakterističnom aromom hrastove bačve, odnosno, barriquea.

26. Mane i kvarenje octa Kemijske ili biološke promjene Promjene okusa zbog reakcije octa s metalima, zamućenje, promjene boje octa i povrća (Fe, Cu, Zn, Pb...) AAB – zaostale u octu ili naknadno dospjele u ocat – zamućenje Octena jeguljica, octene grinje, octene mušice – generator, posude za odležavanje – održavanje čistoće pogona

27. Proizvodnja limunske kiseline Izv. prof. dr. sc. Jasna Mrvčić

28. Limunska kiselina (E330) • Prirodno se nalazi u mnogim vrstama voća • Prirodni antioksidans, sredstvo za zakiseljavanje i reguliranje kiselosti, kompleksiranje.. • Industrijski se proizvodi biotehnološkim postupkom,po masi proizvoda najznačajnija organska kiselina proizvedena biotehnološkim postupkom • Svjetska proizvodnja iznosi 1,4 miliona tona (www.bccresearch.com, 2004) uz predviđeni rast 5% god. • Kina – vodeći svjetski proizvođač, 35–40 % svjetske proizvodnje • Cijena 0,7- 2 $ /kg

29. ...iz povijesti • 1893 – Wehmer - Penicillium glaucum sintetizira limunsku kiselinu tijekom rasta na šećernom supstratu • Problem industrijske proizvodnje – kontaminacije i dugo vririjeme trajanja fermentacije • 1916 - Currie – Aspergillus niger sintetizira limunsku kiselinu tijekom rasta na šećernom supstratu • 1930 – prvi pogoni u Engleskoj, SSSR, Njemačkoj – površinska tehnika uzgoja • mikrobna proizvodnja prevladala je kemijsku sintezu i danas se proizvodi mikrobnim postupkom, submerznom tehnikom uzgoja na melasi kao jeftinom izvoru ugljika s pomoću plijesni A. niger

30. Proizvodnja limunske kiseline

31. Radni mikroorganizam A. niger • filamentozni fungi • transformiraju šećere hranjive podloge u limunsku kiselinu • Rast = spore - hife – micelij • Oblik i struktura micelijskog peleta bitno utječu na prinos i produktivnost – transport hranjiva i kisika • Mikrobna proizvodnja enzima • Tehnike uzgoja – površinski ili submerzno MICELIJSKI PELET

32. Ciklus limunske kiseline (1) Citrat sintaza Akonitaza (Fe, S) Izocit. deh. (Mg, Mn)

33. Ciklus limunske kiseline (2) Proizvodnja limunske kiseline izrazito je osjetljiva na ione teških metala, naročito Fe3+ i Mn2+ Zato se melasa prije procesa obrađuje kalij heksacijanoferatom za uklanjanje navedenih iona iz hranjive podloge Anaplerotske reakcije - Reakcije koje održavaju konstantnu koncentraciju međuprodukata CLK - nadoknada međuprodukata CLK koj su utrošeni u biosintezi

34. Hranjiva podloga • Melasna podloga (10-12 % šećera) • Predobrada melase – taloženje s kalij ferocijanidom, ionski izmjenjivači • Koncentracija Fe3+ mora biti manja od 200 mg/m3, a koncentracija Mn2+ manja od 5 mg/m3 • Pasterizacija (zbog niske pH vrijednosti podloge prirodno zaštićeni proces) ili sterilizacija podloge • Temperatura - 30 oC, a pH na 3 - 5

35. Bioproces • AEROBAN • Tehnike uzgoja: Površinski Submerzno Inokulacija - sporama plijesni Vrijeme procesa – 10 dana,2-3 dana klijanje spora i rast plijesni, dalje uslijed pada pH inhibicija rasta i sinteza kiseline Rast micelija na površini tava Kontaminacije, slaba aeracija... Inokulacija – micelijskim zrncima Propagator – rast radnog m.o. Bioreaktor – zaustavljen rast micelija, biosinteza kiseline Miješanje, homogenizacija, brža izmjena tvari, kraće vrijeme procesa – 7 dana

36. Izdvajanje proizvoda • Dodatak CaO i taloženje kalcij citrata u filtriranoj komini • Filtracija i pranje kristala kalcij citrata • Otapanje kristala kalcij citrata u sulfatnoj kiselini • Filtracija kalcij sulfata (gipsa). • Dekolorizacija i pročišćavanje filtrata, uparavanje, kristalizacija i filtracija • te sušenje kristala monohidrata limunske kiselin