1 / 51

Bioinformatics

Bioinformatics. ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH. NGUYỄN THÁI MINH QUÂN. 1. 3’. 5’. DNA. Học thuyết trung tâm. Sao chép. Phiên mã. mRNA. Dịch mã. Poly-peptide. Protein. PCR (Polymerase Chain Reaction). 3. Phân tích trình tự DNA. Trình tự DNA: Trình tự bộ gene Trình tự một gene

avian
Télécharger la présentation

Bioinformatics

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Bioinformatics ĐẠI HỌC NGUYỄN TẤT THÀNH NGUYỄN THÁI MINH QUÂN 1

  2. 3’ 5’ DNA Học thuyết trung tâm Sao chép Phiên mã mRNA Dịch mã Poly-peptide Protein

  3. PCR (Polymerase Chain Reaction) 3

  4. Phân tích trình tự DNA • Trình tự DNA: • Trình tự bộ gene • Trình tự một gene • Phân tích: • Chuyển đổi trình tự DNA • Dự đoán gene • Thiết lập bản đồ enzyme cắt giới hạn • Thiết kế mồi

  5. Trình tự DNA Giải trình tự …ATGCATGCATG… Phương pháp Sanger DNA bộ gene Bioinformatics Bioinformatics CSDL trình tự gene CSDL trình tự bộ gene

  6. Phương pháp Sanger Nguồn: the-scientist.com 6

  7. Giải mã trình tự bộ gen người Human Genome Project (HGP) Bắt đầu năm 1990 – Hoàn tất 2003 20,000 – 25,000 gene Tổng chi phí 3 tỷ USD Bioinformatics 7

  8. Archon X Prize X Prize Foudation Chi phí giải mã 1 genome: 10 triệu USD Tốc độ 100 genome người trong vòng 10 ngày Độ chính xác 98% trên toàn bộ genome; 1/100,000 Bioinformatics 8

  9. Chuyển đổi trình tự DNA • Dựa trên nguyên tắc bổ sung A-T, G-C • Các dạng chuyển đổi: • Ngược chiều (Reverse) • Bổ sung (Complement)

  10. Gene mục tiêu: 5’-ATTCAGAATA-3’ Phiên mã 3’-TAAGTCTTAT-5’ Ngược chiều và bổ sung Gene mục tiêu: 5’-ATTCAGAATA-3’ Reverse 5’-ATAAGACTTA-3’ Complement GENE ANTISENSE 5’-TATTCTGAAT-3’ Phiên mã 5’-ATTCAGAATA-3’ 3’-ATAAGACTTA-5’

  11. Trình tự DNA: Vị trí tìm được Xác định các vùng chuyên biệt trên DNA Mục tiêu: xác định vị trí các vùng “chức năng” trên DNA: vùng promotor, vùng gene, vùng nhận biết của enzyme cắt giới hạn,… Nguyên tắc: dò tìm tín hiệu đặc trưng dọc theo chiều dài DNA Vùng tín hiệu đặc trưng

  12. Dự đoán gene • Dự đoán gene của virus, phage, plasmid • Dự đoán gene của Prokaryote • Dự đoán gene của Eukaryote

  13. Xác định khung đọc mở (ORF) • ORF (Open Reading Frame) • Trình tự có codon bắt đầu (AUG) và codon kết thúc dịch mã (UAA, UAG, UGA). • Mục tiêu: • Xác định vùng mã hóa cho protein chức năng • Cơ sở thiết kế mồi để dòng hóa, biểu hiện trong vector • Dự đoán chức năng dựa trên các ORF tương đồng đã biết chức năng.

  14. Xác định khung đọc mở (ORF) (tt) Nguyên tắc: dò tìm trên 6 khung đọc vị trí bộ ba mở đầu và bộ ba kết thúc. Trình tự nhập vào:5’ AATGCTAGCTTACGCTATGAGC 3’ Ba khung đọc trên trình tự nhập vào: (+1): 5’ AAT GCT AGC TTA CGC TAT GAG C 3’ (+2): 5’ AATG CTA GCT TAC GCT ATG AGC 3’ (+3): 5’ AATGC TAG CTT ACG CTA TGA GC 3’ Ba khung đọc trên trình tự bổ sung: (-1): 5’ GCT CAT AGC GTA AGC TAG CAT T 3’ (-2): 5’ GCTC ATA GCG TAA GCT AGC ATT 3’ (-3): 5’ GCTCA TAG CGT AAG CTA GCA TT 3’

  15. Enzyme cắt giới hạn • Là enzyme của vi khuẩn có khả năng cắt DNA ở những vị trí chuyên biệt. • Chức năng: bảo vệ tế bào vi khuẩn khỏi sự xâm nhập của DNA lạ. • Khoảng 3000 enzyme được tìm thấy với hơn 200 sự chuyên biệt khác nhau. • Có 3 loại chính: • Loại 1 (1%): nhận diện trình tự dài và cắt tại vị trí xa trình tự nhận diện khoảng 1000bp • Loại 3 (<1%): nhận diện và cắt tại vị trí xa trình tự nhận diện 24-26bp. • Loại 2 (95%): nhận diện đoạn trình tự ngắn (4-6bp) và cắt tại vị trí này. Gồm 2 nhóm: cắt đầu bằng và cắt đầu dính. Được sử dụng nhiều trong tạo dòng.

  16. Thiết lập bản đồ enzyme cắt giới hạn Bản đồ enzyme cắt giới hạn: đánh dấu các vị trí cắt giới hạn trên toàn bộ bộ gen. Nguyên tắc: dò tìm từng vùng trình tự nhận biết của các enzyme cắt giới hạn dọc theo trình tự gốc và xuất ra vị trí tìm thấy. Mục tiêu: Tạo dòng gen Tạo đột biến …

  17. PCR (Polymerase Chain Reaction)

  18. PCR (Polymerase Chain Reaction) 18

  19. Máy luân nhiệt 19

  20. Các thành phần của PCR • DNA khuôn • Polymerase • Nucleotide tự do • Dung dịch đệm • Mồi

  21. DNA khuôn Là các trình tự DNA dùng để tổng hợp trình tự mục tiêu DNA khuôn có thể là toàn bộ genome hoặc được giới hạn bởi các enzyme cắt giới hạn Cả hai mạch đều được sử dụng trong phản ứng PCR Bioinformatics 21

  22. Các loại polymerase dùng trong PCR Tag Polymerase Pfu Polymerase Polymerase thế hệ mới Bioinformatics 22

  23. Tag polymerase Thermus aquaticus Nhiệt độ tối ưu: 75 – 80oC Có thể tồn tại 2 giờ ở 92.5oC, 40’ ở 95oC, 7’ ở 97.5oC Tốc độ: 1,000bp/10s Sai sót: 1/9,000 Bioinformatics 23

  24. Pfu polymerase Pyrococcus furiosus Chịu nhiệt tốt hơn Tag polymerase Có thể tồn tại 6-7h ở 97.5oC Tốc độ: 1,000bp/1-2’ Sai sót: 1/1,300,000 Có hoạt tính sửa sai Bioinformatics 24

  25. Polymerase thế hệ mới Chịu nhiệt tốt Tốc độ cao Sai sót ít Có thể tái sử dụng nhiều lần Bioinformatics 25

  26. Nucleotide tự do Nucleotide tự do là nguồn nguyên liệu để tổng hợp mạch mới Trong một số trường hợp, người ta bổ sung một số nucleotide “lạ” Bioinformatics 26

  27. Dung dịch đệm Ảnh hưởng đến hiệu suất, tính chính xác của phản ứng PCR Ứng với từng loại polymerase, nhà sản xuất khuyến cáo sử dụng dung dịch đệm tương ứng Nồng độ Mg2+ là yếu tố quan trọng: Thiếu: hoạt động của polymerase kém dẫn đến hiệu suất PCR kém Thừa: thu nhận một số sản phẩm không đặc hiệu, tính chính xác thấp Bioinformatics 27

  28. Mồi Mồi trong phản ứng sao chép DNA là những trình tự RNA ngắn được tổng hợp bởi enzyme Primase Mồi trong sinh học phân tử là những đoạn oligonucleotide ngắn được tổng hợp hóa học Ứng dụng: phản ứng PCR, lai phân tử,… Bioinformatics Thiết kế trình tự mồi Bioinformatics 28

  29. Đặc điểm của mồi Tính duy nhất: đảm bảo vị trí bắt cặp là DUY NHẤT trên toàn trình tự Chiều dài mồi: tối thiểu 15 base, thông thường khoảng 17-28 base Thành phần base: thường là tổng (G+C) khoảng 50-60%, tránh trình tự mồi với (A+T) dài Kẹp G/C: tính ổn định ở đầu 3’ ảnh hưởng lớn tới hiệu quả phản ứng, thường 3’ của mồi là G hay C Bioinformatics 29

  30. Đặc điểm của mồi (tiếp theo) Độ ổn định đầu 3’: năng lượng cần để phá hủy sự bắt cặp của 5nu cuối cùng ở đầu 3’, tuy nhiên để tránh bắt cặp nhầm trên các vùng giàu GC, 5nu cuối cùng không nên chứa quá 3G/C Nhiệt độ nóng chảy (Tm): trong giới hạn 52oC – 65oC, không nên cách biệt quá lớn giữa 2 mồi Bioinformatics 30

  31. Các tiêu chuẩn thiết kế mồi • Tính duy nhất • Chiều dài: 17-28 base • Thành phần base: G+C (50-60%), tránh A+T dài • Tối ưu hóa sự bắt cặp và kéo dài: đầu 3’ của mồi có độ bền cao và bắt cặp cao • Nhiệt độ nóng chảy trong giới hạn 48-65˚C • Sự khác biệt nhiệt độ nóng chảy mồi xuôi và mồi ngược < 5˚C • Giảm thiểu sự tự tạo thành cấu trúc bậc hai của mồi

  32. Ảnh hưởng của cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 2 giữa hai mồi là sự bắt cặp bổ sung toàn bộ hay một phần giữa hai mồi Cấu trúc bậc 2 làm mồi mất khả năng gắn vào DNA mục tiêu Giảm số lượng mồi tự do trong môi trường Giảm hiệu quả của phản ứng PCR Bioinformatics 32

  33. Hairpin

  34. Self-Dimer Bioinformatics 34

  35. Dimer Bioinformatics 35

  36. 5’ 3’ 5’ 3’ 3’ 5’ Mồi hợp lệ? 5’ 3’

  37. Tóm tắt về mồi Đặc tính: Các yếu tố cần quan tâm: Tính duy nhất Tính đặc hiệu Đặc hiệu cho trình tự đích (tránh các liên kết không đặc hiệu) Chiều dài Thành phần base Tính bền Tính bền Hình thành thể lai bền với đoạn mẫu trong p/ứ PCR Nhiệt độ nóng chảy Nhiệt độ hồi tính Cấu trúc mồi Tính tương thích Các đoạn mồi phải chịu cùng một điều kiện trong p/ứ PCR Sự bắt cặp giữa 2 mồi Slide 37

  38. THIẾT KẾ MỒI BẰNG CÁC CÔNG CỤ Oligo: Life Science Software GCG: Accelrys, ICBR maintains the server. Primer3: MIT, standalone / web application (http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi) BioTools: BioTools, Inc. ICBR distributes the license. Khác: GeneFisher, Primer!, Web Primer, NBI oligo program, ... Oligo Explorer Version 1.1 Slide 38

  39. Mục đích thiết kế mồi Thiết kế mồi dòng hóa (Cloning) Thiết kế mồi phát hiện (Detecting) Bioinformatics 39

  40. Thiết kế mồi dòng hóa Mồi dòng hóa nhằm mục đích nhân bản một đoạn gen mục tiêu Sản phẩm của phản ứng PCR được giới hạn bởi 2 mồi xuôi và ngược Vùng mở đầu và kết thúc của một gen phải được đảm bảo Bioinformatics 40

  41. Yêu cầu đối với mồi dòng hóa Mồi xuôi và mồi ngược phải đảm bảo cho sản phẩm tối ưu nhất, đặc biệt đầu 3’ Phải lưu ý đến nhiệt độ tách mạch trình tự, nhiệt độ giữa 2 mồi không quá khác biệt và nhiệt độ của sản phẩm Thời gian của các chu trình phải đảm bảo sản phẩm được tổng hợp hoàn toàn Bioinformatics 41

  42. Thiết kế mồi phát hiện Mồi phát hiện nhằm mục đích phát hiện sự tồn tại của một trình tự nào đó. Mồi phát hiện phải được thiết kế trên một trình tự chuyên biệt cho một loài hay một nhóm loài quan tâm. Bioinformatics 42

  43. Yêu cầu đối với mồi phát hiện Tính chuyên biệt Thời gian của các chu trình vừa đủ để tổng hợp sản phẩm cần thiết Trình tự của sản phẩm phải vừa đủ cho sự chuyên biệt nhưng không quá dài. Bioinformatics 43

  44. Động học của phản ứng PCR Tăng trưởng mũ Tăng tuyến tính Bão hòa Bioinformatics 44

  45. Bioinformatics 45 Nguồn: thuvienkhoahoc.com

  46. Kiểm tra kết quả PCR – Điện di Điện di là hiện tượng dịch chuyển của các vật thể mang điện tích dưới tác động của điện trường Là 1 kỹ thuật phân tích phân tử DNA, RNA và protein dựa trên đặc điểm vật lý của chúng Bioinformatics 46

  47. Điện di – Thành phần Gel (thường là agarose hoặc polyacrylamide) được cấu trúc với các kích thước lỗ xác định. Dung dịch đệm để dẫn điện và tạo điện trường, chứa một số chất nhuộm để xác định vị trí phân tử trên bản gel. Bioinformatics 47

  48. Điện di – Hoạt động Các phân tử sinh học dịch chuyển trong điện trường với một tốc độ khác nhau giới hạn bởi kích thước phân tử, cấu trúc nội phân tử, cấu trúc và kích thước lỗ của bản gel Thời gian là một yếu tố quyết định quãng đường dịch chuyển Bioinformatics 48

  49. Điện di – Kết quả Bioinformatics 49

  50. Điện di – Kết quả (tt) Bioinformatics 50

More Related