专题一基因工程

专题一基因工程 基因工程是指按照人们的意愿，进行严格的设计，并通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，从而创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫做DNA重组技术。

一、DNA重组技术的基本工具 （一）限制性核酸内切酶——“分子手术刀” 1.分布：主要从原核生物中分离纯化出来 2.特点：特异性，即能够识别双链DNA分子的某种特定核苷酸序列，并且切割每一条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键，使之断开。

3.结果： 在识别序列中轴线两侧切割，产生粘性末端；在识别序列中轴线处切割，产生平末端。 ↓ ︰︰︰ G A AT T C G A A T T C EcoRⅠ （在G与A之间切割） C T TA A G C T T A A G ↑ 粘性末端中轴线︰︰︰ ↓ C C CG G G C C C G G G SmaⅠ （在G与C之间切割） G G G C C C G G GC C C ↑ 平末端切割DNA分子产生的两种不同的末端（箭头表示酶的切割位点）

G G A A T T C A A T T C C T T A A C T T A A G G （二）DNA连接酶——“分子缝合针”

G A A T T C C T T A A G （二）DNA连接酶——“分子缝合针”

1.连接酶的作用： G A A T T C C T T A A G 磷酸二酯键磷酸二酯键（二）DNA连接酶——“分子缝合针” 将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子磷酸二酯键，不是氢键 2.连接酶的部位：

3.连接酶的类型（按来源分类） 只能连接双链DNA片段互补的粘性末端 (1)E.coli DNA连接酶： (来源于大肠杆菌) 既可以连接双链DNA片段互补的粘性末端，又可以“缝合”双链DNA片段的平末端 (2) T4DNA连接酶：（来源于T4噬菌体）

（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车”（三）基因进入受体细胞的载体——“分子运输车” 1.作用：将外源基因送入受体细胞 • 2.条件： • 能在宿主细胞内复制并稳定地保存； • 具有多个限制酶切位点,便于目的基因插入； • 具有标记基因，便于筛选； • 必需是安全的，对宿主细胞无害。

3.种类： 质粒、λ噬菌体的衍生物、动植物病毒 • 质粒 • 细菌拟核DNA之外能自主复制的小型双链环状DNA分子； • DNA分子上具有多个限制酶切割位点； • 只能在宿主细胞中进行自我复制； • DNA分子上具有特殊的标记基因； • 对宿主细胞无影响。

二、基因工程的基本操作程序 获取目的基因第一步第二步构建表达载体第三步导入受体细胞第四步目的基因检测与鉴定

（一）目的基因的获取 1.从基因文库中获取目的基因将含有某种生物不同基因的许多片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。（1）基因组文库受体菌包含了某种生物所有的基因，该受体菌群体称为这种生物的基因组文库。（2）部分基因文库受体菌包含了一种生物部分基因，该受体菌群体称为这种生物的部分基因文库，如cDNA文库。

（3）基因文库的构建 • 基因组文库的构建提取某生物全部DNA 许多 DNA片段该生物基因组文库用适当限制酶切割与载体连接导入受体菌群（每个受体菌含有一段不同的DNA片段） • cDNA文库的构建——mRNA反转录形成该生物 cDNA文库与载体连接导入受体菌群逆转录酶核酸酶H DNA聚合酶 mRNA 杂交双链双链DNA 单链DNA

2.利用PCR技术扩增目的基因 (1) 原理 PCR是聚合酶链式反应（polymerase chain reaction）,它是利用DNA 双链复制的原理，将基因的核苷酸序列不断的加以复制，使其数量呈指数方式增加。因为整个过程是在体外进行，所以又叫做体外DNA扩增技术。

(2) 过程 高温变性（90~95℃）低温退火（55~60℃）多次重复中温延伸（70~75℃） (3)特点：指数形式扩增 • 双链DNA是在高温条件下解链为单链DNA的，因此整个过程不需要解旋酶。

DNA合成仪 3.通过DNA合成仪直接合成目的基因当基因比较小、蛋白质的氨基酸序列可以测得或核苷酸序列已知时，可采用此种方法。合成推测推测基因DNA的核苷酸序列目的基因蛋白质的氨基酸顺序 mRAN 核苷酸序列

用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。用限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连接酶的作用下连接形成重组DNA分子，即基因表达载体。（二）基因表达载体的构建

DNA连接酶 重组DNA （二）基因表达载体的构建质粒限制酶目的基因

（二）基因表达载体的构建 1.构建目的使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可遗传给下一代，同时，使目的基因能够表达和发挥作用。 2.构建零件及其作用（1）目的基因（2）启动子RNA聚合酶识别和结合的一段特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，RNA聚合酶与之结合才能驱动基因转录出mRNA，进而获得需要的蛋白质。

（二）基因表达载体的构建 2.构建零件及其作用（3）终止子一段特殊结构的DNA片段，位于基因的尾端，作用是使转录在所需要的地方停止。（4）标记基因鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。

（三）将目的基因导入受体细胞 将目的基因导入受体细胞并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程称为转化。基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞的方法主要是借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径，且因受体细胞的不同而不同。

1.导入植物细胞 （1）农杆菌转化法（2）其他方法 • 基因枪法 • 花粉管通道法

2.导入动物细胞 (显微注射技术) 动物的受精卵含目的基因的表达载体显微注射含目的基因的受精卵分裂分化早期胚胎雌性动物输卵管或子宫转基因动物发育移植

3.导入微生物细胞 (Ca2+处理法) (1)过程 • 制备感受态细胞：用Ca2+（CaCl2）处理细菌，使细菌易于接 • 受外源DNA分子。 • 重组DNA分子与感受态细胞混合孵育，完成转化。 (2)优点繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少、操作简单、价格低廉。 (3)常用受体细胞大肠杆菌（E.coli）

（四）目的基因的检测与鉴定 目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。常用的检测手段主要从分子水平和个体水平进行。

1.分子水平 （分子杂交技术）（1）检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因提取受体生物全部DNA 适当限制酶切割许多 DNA片段显出杂交带用同位素标记的目的基因片段杂交（表明目的基因已插入）

1.分子水平 （分子杂交技术） (2) 检测目的基因是否转录出了mRNA 显出杂交带用同位素标记的目的基因片段杂交提取受体生物的mRNA （表明目的基因已转录出了mRNA）检测DNA利用的是DNA与DNA杂交，检测mRNA利用的是DNA与mRNA杂交。

1.分子水平 （分子杂交技术）（3）检测目的基因是否翻译出蛋白质（抗原—抗体杂交技术）与相应抗体杂交提取受体生物的蛋白质显出杂交带（表明目的基因已形成蛋白质产品）

2.个体水平 例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，则说明摄入了抗虫基因并得到表达。

1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述1.用基因工程技术可使大肠杆菌合成人的蛋白质。下列叙述不正确的是（） A.常用相同的限制性内切酶处理目的基因和质粒 B.导入大肠杆菌的目的基因不一定能成功表达 C.DNA连接酶和 RNA聚合酶是构建重组质粒必需的工具酶 D.可用含抗生素的培养基检测大肠杆菌中是否导入了重组质粒 C 2.下列关于基因工程中限制性内切酶的描述，错误的是（）A.一种限制性内切酶只能识别一种特定的脱氧核苷酸序列B.限制性内切酶的活性受温度的影响C.限制性内切酶能识别和切割RNAD.限制性内切酶可从原核生物中提取 C

A 构建 B 培养选择导入含重组质粒土壤农杆菌重组质粒土壤农杆菌侵染抗虫基因含kanr质粒 C 诱导选择离体棉花叶片组织 D 检测分化转基因抗虫植株愈伤组织再生植株 3.在培育转基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kanr）常作为标记基因，只有含卡那霉素抗性基因的细胞才能在卡那霉素培养基上生长。下图为获得抗虫棉的技术流程。请据图回答：（1）A过程需要的酶有_____________________________________。（2）B过程及其结果体现了质粒作为运载体必须具备的两个条件是 __________________________________________________。（3）C过程的培养基除含有必要营养物质、琼脂和激素外，还必须加入________________。（4）如果利用DNA分子杂交原理对再生植株进行检测，D过程应该用 ________________ ________________ ___________作为探针。限制性内切酶和DNA连接酶具有标记基因；能在宿主细胞内复制并稳定保存卡那霉素放射性同位素（或荧光分子）标记后的抗虫基因

A 构建 B 培养选择导入含重组质粒土壤农杆菌重组质粒土壤农杆菌侵染抗虫基因含kanr质粒 C 诱导选择离体棉花叶片组织 D 检测分化转基因抗虫植株愈伤组织再生植株（5）科学家发现转基因植株的卡那霉素抗性基因的传递符合孟德尔遗传规律。 ①将转基因植株与________________________杂交，其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为1：1。 ②若该转基因植株自交，则其后代中抗卡那霉素型与卡那霉素敏感型的数量比为________。 ③若将该转基因植株的花药在卡那霉素培养基上作离体培养，则获得的再生植株群体中抗卡那霉素型植株占________%。非转基因植株 3：1 100

三、基因工程的应用 （一）植物基因工程 • 抗虫转基因植物 • 抗病转基因植物 • 抗逆转基因植物 • 改良植物品质如转基因抗虫棉（水稻）减轻农药对环境的污染抗病毒（细菌、真菌）转基因植物，如抗病毒转基因小麦、抗病毒转基因烟草等如转鱼抗冻蛋白基因番茄、转基因抗除草剂玉米如富含赖氨酸的转基因玉米、转番茄基因的延熟番茄

三、基因工程的应用 （二）动物基因工程 • 提高动物生长速度 • 改善畜产品的品质 • 生产药物 • 做器官移植供体如转生长激素基因鲤鱼如低乳糖转基因牛（转肠乳糖酶基因）如乳腺生物反应器利用基因工程改造供体器官，抑制或去除供体器官抗原决定基因的表达，获得没有免疫排斥反应的转基因克隆猪器官

三、基因工程的应用 （三）基因工程药物利用基因工程技术，通过微生物生产蛋白质类药品。 • 生长激素 • 干扰素 • 胰岛素

三、基因工程的应用 （四）基因治疗基因治疗就是将正常基因导入病人体内，使该基因的表达产物发挥功能，从而达到治疗疾病的目的。基因治疗是治疗遗传病最有效的手段。

（四）基因治疗 • 体外基因治疗从病人体内获得某种细胞，进行培养，在体外完成基因转移，筛选成功转移的细胞扩增培养，再重新输入患者体内的治疗方法。 • 体内基因治疗直接向人体组织细胞中转移基因的治病方法。

SCID的基因工程治疗

四、蛋白质工程 以蛋白质分子的结构规律及其与生物功能的关系作为基础，通过基因修饰或基因合成，对现有蛋白质进行改造，或制造一种新的蛋白质，以满足人类对生产和生活的需求。

四、蛋白质工程 （一）原理中心法则的逆推（二）过程基因 DNA 预期功能 DNA合成分子设计氨基酸序列多肽链蛋白质三维结构 mRNA 生物功能折叠转录翻译

专题二细胞工程 细胞工程是指应用细胞生物学和分子生物学的原理和方法，通过细胞整体水平或细胞器水平上的操作，按照人们的意愿来改变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一门综合科学技术。按照操作对象不同，可分为植物细胞工程和动物细胞工程两大领域。

植物细胞工程 植物组织培养是在无菌和人工控制条件下，将离体的植物器官、组织、细胞，培养在人工配制的培养基上，给予适宜的培养条件，诱导其产生愈伤组织、丛芽，最终形成完整的植株。

一、理论基础——细胞的全能性 1.概念：细胞全能性是指细胞具有形成机体所有细胞类型的能力，是细胞的一种特征。 2.基础：生物体的每一个细胞都含有该物种所特有的全套遗传物质，都有发育成为完整个体所必需的全部基因。 3.全能性大小 • 受精卵＞生殖细胞＞体细胞体细胞（分化程度低的细胞＞分化程度高的细胞） • 植物细胞＞动物细胞

二、植物细胞工程的基本技术 （一）植物组织培养技术 1、过程离体器官组织细胞脱分化营养激素再分化营养激素愈伤组织根、芽植物体 • 脱分化：已经高度分化的植物细胞经诱导后，失去特有的结构和功能而转变成未分化细胞的过程，即形成愈伤组织。 • 再分化：脱分化产生的愈伤组织继续进行培养，又重新分化成根或芽等器官。

二、植物细胞工程的基本技术 （一）植物组织培养技术 2、条件离体、提供营养的培养基、激素及其他适宜条件（温度、O2、pH、无菌、光照）。

原生质体A 去掉细胞壁 A 原生质体融合融合原生质体原生质体B B 愈伤组织（二）植物体细胞杂交技术 1、过程杂种细胞杂种植株

去壁酶解法原生质体A 原生质体B 诱导融合原生质体生壁杂种细胞植物组织培养脱分化愈伤组织再分化杂种植物植物细胞A 植物细胞B 融合

2、意义 与有性杂交（种内）相比，植物体细胞杂交克服了远缘杂交不亲合的障碍，大大扩展了可用于杂交的亲本组合范围（种间、属间），并且培育出了许多在生产上有较高应用价值的杂种植株品种。

三、植物细胞工程的实际应用 1、微型繁殖 • 概念：快速繁殖优良品种的植物组织培养技术，也叫快速繁殖技术。 • 特点： • 繁殖速度快，即具有高效性 • 保持优良品种的遗传特性，即具有高保真性

三、植物细胞工程的实际应用 2、培育脱毒作物 • 原因：无性繁殖的作物，感染的病毒易传播给后代，病毒在作物体内逐年积累，会导致作物产量降低，品质变差。 • 材料：植物分生区（如茎尖）。 • 方法：切取茎尖进行组织培养，获得脱毒苗。

三、植物细胞工程的实际应用 3、人工种子植物组织培养得到的胚状体、不定芽、顶芽、腋芽等包裹在人工薄膜（人工种皮）内形成的结构。 • 技术：组织培养 • 特性：在适宜条件下可以萌发长成幼苗 • 优点 • 后代无性状分离，保持优良特性 • 不受季节、气候和地域的限制

专题一 基因工程