Impianti BioChimici

1. Impianti BioChimici Docente: prof. Ing. Maria Laura MASTELLONE Facoltà di Scienze Ambientali Seconda Università di Napoli

2. Programma del corso principi dei processi biologici. cenni introduttivi sugli organismi e le colture cellulari. caratterizzazione dei substrati. stechiometria ed esempi di calcolo cinetica biologica. principi di reattoristica biologica: reattori ideali e reattori multistadio in serie. equazioni di progetto. bioreattori a biomassa sospesa e a biomassa adesa. applicazioni (trattamento delle acque). processi di depurazione biologica: fanghi attivi, letti percolatori, stagni biologici, nitrificazione, denitrificazione, defosfatazione. interventi di salvaguardia degli ambienti naturali tramite impianti biologici (trattamento dei rifiuti solidi).

3. Introduzione L’ingegneria biochimica • La differenza tra l’ingegneria biochimica e l’ingegneria chimica non risiede nei principi delle operazioni e dei processi unitari bensì nella natura dei sistemi reagenti. Gli impianti biochimici, infatti, convertono una materia vivente come le cellule o gli enzimi estratti da queste ultime. • L’utilizzo di tali sistemi viventi comporta una scelta dei parametri di funzionamento degli impianti biochimici molto ristretta in quanto essi devono coincidere con quelli della biosfera. Parametri quali temperatura, pH, potenziale redox e ambiente (medium) reagente sono quindi ben definiti.

4. Introduzione Definizioni • La cellula. Le cellule sono la più piccola unità di vita. Esse possono interagire tra loro (organismi multicellulari) o essere completamente indipendenti (o. unicellulari). Strutturalmente la cellula può contenere il citoplasma (sistema colloidale formato da molecole organiche più piccole e sali inorganici in soluzione circondato da una membrana permeabile) attraverso cui si hanno fenomeni di trasporto in-out. I cromosomi, che trasmettono le informazioni genetiche da una generazione all’altra, sono, nella maggior parte delle cellule, circondati da una membrana a formare un nucleo. Le cellule in cui esiste tale nucleo sono definite eucariote. Vi sono poi altre strutture intracellulari che servono per attività specifiche. • Nell’ambito dell’ing. biochimica sono molto importanti tre tipi di microorganismi: batteri, alghe e funghi.

5. Definizioni • I batteri. I batteri sono organismi uni-cellulari le cui dimensioni sono in media comprese tra 0.5 e 20 mm. La loro forma dipende da quella delle pareti cellulari e può essere sferica, ovoidale, a spirale o a filamento. Il citoplasma dei batteri spesso contiene materiale di supporto come carboidrati e lipidi. Questi microorganismi si muovono grazie ad uno o più flagelli. In condizioni ambientali avverse molti batteri producono delle spore che possono resistere in condizioni estremamente avverse e che possono germinare una volta ripristinato un ambiente idoneo. • Le alghe. Esse sono organismi fotosintetici la cui grandezza può arrivare fino a diverse decine di metri. Sono organismi molto importanti nei processi di depurazione biologica poiché consumano nutrienti e forniscono ossigeno.

6. Definizioni • I funghi. Questi organismi non possiedono clorofilla per cui hanno bisogno di molecole organiche complesse come nutrienti. Essi sono parassiti oppure crescono su materiale organico morto. • I virus. Questi hanno dimensioni al di sotto della soglia dei microscopi leggari, non possiedono una struttura cellulare e sono composti prevalentemente da acidi nucleici circondati da una guaina proteica. Essi vivono come parassiti all’interno di altri organismi come i batteri. In questo caso essi sono batteriofagi se portano alla morte della cellula ospite. Vi sono casi in cui la cellula ospite vive e si riproduce per generazioni prima che il virus l’attacchi.

7. Principi dei processi biologici. Cenni introduttivi sugli organismi e le colture cellulari. Caratterizzazione dei substrati.

8. Principi dei processi biologici Processi metabolici:Classificazione dei microrganismi • Gli esseri viventi microscopici con organizzazione biologica molto semplificata rispetto a piante ed animali vengono raggruppati in un regno proprio, detto dei protisti. Ad esso appartengono tutte le specie monocellulari (ovvero con gli organismi composti da una unica cellula) o pluricellulari ma con gli organismi composti da cellule tutte dello stesso tipo. I microrganismi colonizzano praticamente ogni ambiente naturale e sono inoltre caratterizzati da una intensa attività che si traduce in una elevata velocità di crescita. • I microrganismi all’interno del regno dei protisti si differenziano essenzialmente sulla base della morfologia cellulare, del modo di riprodursi e delle esigenze nutrizionali. Una prima classificazione divide, a seconda della struttura della cellula, i protisti in procarioti ed eucarioti

9. La cellula procariote è molto piccola (da 0.5 a 3 mm) e generalmente costituisce da sola un organismo completo. Ha struttura molto semplice, è racchiusa in una parete ed in una membrana cellulare, ma non presenta una membrana intorno al nucleo; ha in genere forma di sfera, di spirale o di bastoncino. Sono procarioti i batteri, i più diffusi tra i microrganismi ed i più utilizzati nelle attività umane, che possiedono caratteristiche di alta attività e adattabilità molto spiccate. • La cellula eucariote è molto più grande di quella procariote (da 1.000 a 10.000 volte), ha una struttura interna molto più complessa ed organizzata con il nucleo racchiuso in una membrana porosa. È tipicamente la cellula degli organismi superiori ma può esistere anche come singolo individuo. Tra gli eucarioti molto diffusi sono i funghi, in genere in ambienti ad umidità relativa più bassa che nel caso dei batteri. I funghi possono essere organismi a morfologia complessa, come le muffe, o semplici e piccoli monocellulari, come i lieviti. Altri importanti eucarioti sono i protozoi, strutture altamente organizzate e sofisticate, che giocano un ruolo importante nel trattamento biologico delle acque di scarico.

10. Principi dei processi biologici Processi metabolici:Il metabolismo cellulare La vita nel mondo dei protisti può essere ricondotta al funzionamento della cellula.Unacellula è un sistema aperto capace di ricavare dall’ambiente circostante l’energia e la materia necessari a mantenersi in vita ed a riprodursi. A tal fine la cellula è capace di far avvenire processi quali il trasporto di sostanze al suo interno e la trasformazione di queste nei materiali cellulari necessari al mantenimento in vita ed alla riproduzione. In generale le reazioni chimiche che presiedono a tali processi sono energeticamente sfavorite (endoergoniche) e per guidarne lo svolgimento la cellula è in grado di trasferire l’energia ricavata ed immagazzinata da altre reazioni caratterizzate da diminuzione di energia libera (esoergoniche). L’insieme ordinato delle reazioni chimiche (eso ed endoergoniche) che presiedono alle funzioni di mantenimento e riproduzione della cellula prende il nome di metabolismo e comprende più di 1000 reazioni indipendenti. A tale complesso sistema si applicano le medesime restrizioni di bilancio materiale ed energetico e le regole della termodinamica che definiscono un processo chimico.

11. ComposizioneelementarediE. coli Peso secco (%) Carbonio 50 Azoto 14 Fosforo 3 Potassio 1 Calcio 0.5 Cloro 0.5 Ossigeno 20 Idrogeno 8 Zolfo 1 Sodio 1 Magnesio 0.5 Ferro 0.2 altri 0.3 La biosintesi Una cellula è composta di molti elementi chimici, un piccolo numero dei quali sono in netta predominanza rispetto a tutti gli altri. La composizione elementare tipica di una cellula microbica è riportata in tabella. Oltre agli elementi elencati i microrganismi contengono tracce di molti altri elementi quali manganese, cobalto, rame, zinco, boro, alluminio, vanadio, molibdeno, iodio, silicio, fluoro e stagno. Tutti gli elementi citati giocano un qualche ruolo nel metabolismo cellulare: il primo requisito per sostenere lo sviluppo e la riproduzione di una cellula è che essi possano essere assunti dal mezzo circostante in proporzione stechiometrica rispetto alla composizione del nuovo materiale cellulare.

12. I quattro elementi principali (carbonio, azoto, ossigeno ed idrogeno) rappresentano più del 90% del peso secco della cellula; insieme con zolfo e fosforo, concorrono alla formazione delle diverse classi di polimeri biologici e sono presenti essenzialmente in questa forma nel materiale cellulare. La maggior parte dei costituenti polimerici della cellula appartiene alla categoria dei polisaccaridi (circa 6%), dei lipidi (circa 15%), delle proteine (circa 60%) e degli acidi nucleici (circa 19%). Queste macromolecole sono prodotte nella cellula a partire da un numero relativamente piccolo di precursori (ovvero circa 15 monosaccaridi, 20 aminoacidi, 20 acidi grassi e precursori dei lipidi e ribonucleotidi e deossiribonucleotidi) per un totale di circa 70 diversi tipi di unità monomeriche. Alcuni di questi monomeri possono o devono essere assunti direttamente dall’esterno mentre altri possono essere sintetizzati da altri precursori. In generale i diversi elementi costituenti la cellula entrano al suo interno sotto forma di molecole molto semplici (spesso inorganiche) e subiscono una complessa serie di reazioni chimiche prima di essere trasformati nei materiali cellulari. Ciò è anche dovuto al fatto che solo molecole relativamente semplici e di piccole dimensioni sono in grado di attraversare la membrana cellulare e partecipare quindi alle attività metaboliche interne alla cellula.

13. L’attività biosintetica (anabolismo) è caratterizzata da una fitta rete di reazioni interconnesse. I prodotti finali sono ottenuti in genere con una serie di passaggi intermedi ed esistono spesso diversi percorsi possibili per ottenere lo stesso prodotto. Questa complessa rete di reazioni chimiche viene diretta e controllata dalla cellula attraverso gli enzimi (proteine con attività catalitica altamente specifica). Ciascun passaggio di un percorso metabolico è accelerato dalla catalisi di uno o più enzimi specifici e quindi la presenza, concentrazione ed attività dei diversi enzimi consente ed orienta l’attività anabolica. Poiché gli enzimi stessi sono sintetizzati nell’attività anabolica della cellula, in essi risiede uno dei principali meccanismi di autocontrollo della cellula e di adattamento a modifiche dell’ambiente esterno. Siccome solo molecole semplici e di piccole dimensioni sono in grado di attraversare la membrana cellulare e poiché molto spesso i materiali a disposizione nell’ambiente esterno sono più complessi ed addirittura simili al materiale cellulare stesso (quali polimeri come polisaccaridi, proteine e grassi) e non possono quindi penetrare la membrana cellulare, l’attività metabolica della cellula deve perciò estendersi al suo esterno con il favorire (ancora mediante enzimi esocellulari) una prima degradazione di tali materiali polimerici.

14. Processi metabolici:Il metabolismo energetico La sintesi delle diverse sostanze richiede, oltre agli opportuni precursori, la disponibilità di energia, essendo in generale le reazioni biosintetiche energeticamente sfavorite. Inoltre l’attività biosintetica richiede la disponibilità di un certo “potere riducente”. In entrambi i casi le cellule ricavano tale disponibilità da reazioni chimiche (ossidazione di sostanze) o fotochimiche (assorbimento di energia radiante). In un sistema abiotico però le reazioni chimiche normalmente sfruttate dalla cellula per ricavare energia avverrebbero con modalità molto diverse. Esse sarebbero caratterizzate da meccanismi di reazione con pochi stadi reattivi elementari, cinetica quasi nulla alle basse temperature e dissipazione della differenza di energia tra stadi iniziali e finali sotto forma di calore. Nel metabolismo cellulare il cammino puramente chimico di tali reazioni è modificato mediante una serie di enzimi, che favoriscono cineticamente determinate trasformazioni intermedie dei reagenti. Nel far questo accelerano e dirigono la velocità complessiva della reazione globale in una serie precisa di stadi successivi caratterizzati da minori differenze energetiche.

15. Alcune delle reazioni suddette vengono mediate da composti cellulari che immagazzinano parte del guadagno energetico della reazione mediante la formazione di legami ricchi di energia ma facilmente idrolizzabili (ovvero in grado di restituire facilmente l’energia immagazzinata). Nella stessa serie di reazioni, altri composti cellulari si riducono ed immagazzinano così potere riducente. Tale potere riducente può poi essere utilizzato per produrre altra energia con reazioni di ossidazione oppure per consentire la sintesi del materiale cellulare. Anche se le reazioni coinvolte variano moltissimo a seconda del microrganismo interessato e della sostanza di partenza, questa capacità di trasferire energia e potere riducente da reazioni esoergoniche a reazioni endoergoniche è del tutto generale della vita cellulare e quindi della vita stessa. Il trasferimento di energia da reazioni esoergoniche a reazioni endoergoniche avviene per il tramite dell’alternanza di formazione ed idrolisi di un composto organico contenente fosfato, l’acido adenosintrifosforico ed il suo anione derivato, l’adenosintrifosfato (ATP).

16. L’idrolisi dell’ATP con il distacco di una molecola di fosfato e la formazione di ADP (adenosindifosfato), secondo la: ATP + H2O ↔ ADP + Pi (dove Pi indica fosfato inorganico) è energeticamente favorita. Nel sistema biologico tale energia non è persa come calore ma viene utilizzata, con la mediazione enzimatica, per consentire il contemporaneo svolgimento di reazioni endoergoniche. In modo inverso, nei percorsi catabolici le reazioni esoergoniche vengono guidate dagli enzimi in modo da avvenire in contemporanea con la riformazione di ATP da ADP. La formazione di ATP può derivare sia dal trasferimento di fosfato da composti organici con legami ad ancora più alto contenuto energetico sia per diretta addizione di fosfato inorganico. Il trasferimento di potere riducente è invece mediato da derivati nucleotidici, in particolare dal nicotinamideadenindinucleotide (NAD) e dal fosfato nicotinamideadenindinucleotide (NADP). Se la riduzione di una sostanza organica avviene con la mediazione biologica, in genere, comporta l’addizione di atomi di idrogeno (idrogenazione). All’inverso l’ossidazione corrisponde ad una deidrogenazione. NAD e NADP contengono il gruppo nicotinamide che subisce facilmente in maniera reversibile le reazioni di idrogenazione e deidrogenazione. La reazione di NAD e NADP viene in genere simbolizzata come: NAD++2H↔NADH+H+ eNADP+ + 2H ↔ NADPH + H+

17. Il potere riducente (ovvero elettroni o atomi di idrogeno) viene perciò accumulato nel corso dei percorsi catabolici nelle forme ridotte NADH e NADPH, pronto ad essere rilasciato tornando alle forme ossidate, ad esempio nei percorsi anabolici. Trasferimento di energia e di potere riducente sono strettamente accoppiati. Parte del potere riducente accumulato può contribuire direttamente all’immagazzinamento di energia: come si vedrà meglio in seguito, nel caso di presenza di un accettore esterno di elettroni, quale l’ossigeno, NADH e NADPH sono direttamente ossidati con formazione di ATP da ADP e fosfato inorganico (fosforilazione ossidativa).

18. Processi metabolici: Classificazioni metaboliche Si è visto che per la vita cellulare è necessaria disponibilità dall’ambiente esterno alla cellula di alcuni materiali e di energia. Una distinzione importante nel tipo di metabolismo riguarda il modo attraverso cui i diversi microrganismi si procurano il carbonio (il principale costituente cellulare) per l’attività anabolica. La fonte di carbonio può essere costituita da carbonio inorganico (anidride carbonica) o carbonio organico (sostanze organiche quali carboidrati, grassi, proteine ed altro). I microrganismi che possono servirsi della sola anidride carbonica quale fonte di carbonio vengono definiti autotrofi mentre nel secondo caso vengono definiti eterotrofi. Per quanto riguarda la fonte di energia, come già detto, esistono microrganismi che derivano l’energia necessaria dalla luce (fototrofi) e microrganismi che la derivano dalla ossidazione di sostanze chimiche ridotte (chemotrofi). Come è riportato in tabella, la combinazione di questi due fattori porta a quattro categorie principali di metabolismo.

20. Dal punto di vista dell’utilizzo nei reattori biologici, i gruppi di maggior rilievo sono senz’altro i chemotrofi e, in particolare, i chemoeterotrofi. Tra questi due gruppi e all’interno di essi possono essere individuate altre importanti differenze che riguardano la natura dei composti chimici da cui procurarsi l’energia necessaria alla crescita. I microrganismi chemoautotrofi ricavano l’energia dalla ossidazione di sostanze inorganiche quali idrogeno, ammonio o solfuro (e sono perciò detti anche litotrofi), mentre i microrganismi chemoeterotrofi ricavano l’energia, come pure la fonte di carbonio, dall’ossidazione di sostanza organica. In entrambi i gruppi, con il meccanismo della respirazione i microrganismi accoppiano l’ossidazione della sostanza ridotta alla riduzione di un agente ossidante inorganico esterno. Nel caso questo agente sia l’ossigeno si ha la respirazione aerobica mentre nel caso degli altri agenti, quali nitrato o solfato o anidride carbonica, si ha la respirazione anaerobica. Tra i chemoeterotrofi esistono inoltre organismi in grado di ossidare la sostanza organica a spese di un altro agente organico prodotto internamente (operando in pratica una disproporzione interna). In questo caso si è ugualmente di fronte ad un metabolismo anaerobio, che prende il nome di fermentazione anaerobica.

21. Stechiometria ed esempi di calcolo

22. Energia (catabolismo) e sintesi (anabolismo) Un microorganismo, nel corso della sua esistenza, cresce e si moltiplica. Per espletare queste due funzioni ha a disposizione due processi: quello energetico e quello sintetico. La sintesi gli permette di costruirsi quelle molecole che sono necessarie per lo sviluppo e la riproduzione; si tratta perciò di un processo che implica una richiesta di materiali ed un certo lavoro e quindi una richiesta di energia. Questa energia viene ottenuta attraverso reazioni di ossidazione biochimica od attraverso fotosintesi. Nei trattamenti biologici degli scarichi vengono sfruttati ambedue i processi che, simultaneamente, ma per vie diverse, utilizzano il materiale organico presente nell’acqua. L’ossidazione di una parte della sostanza organica infatti fornisce l’energia, mentre una seconda parte viene utilizzata come elemento nutritizio. Nella sintesi però i materiali rimossi vanno a costituire materia vivente dei batteri, mentre nel processo energetico si ottengono dei materiali finali stabilizzati che vengono estromessi come cataboliti gassosi, H2O, ecc.

24. Fenomeni di trasporto e reazione biochimica Ogni reazione biochimica che avviene all’interno del batterio, a livello sia di catabolismo che di anabolismo, necessita prima di un sistema di trasporto dei substrati, ioni e gas che si trovano nell’ambiente liquido esterno affinché essi attraversino le membrane che contornano e delimitano il batterio e raggiungano i siti specifici di reazione all’interno di questi. Questo trasporto può avvenire sostanzialmente in tre modi: trasporto passivo, trasporto attivo, trasporto misto. Trasporto passivo: è un fenomeno fisico spontaneo che non richiede un apporto energetico da parte del batterio, con una velocità di trasporto direttamente proporzionale al cosiddetto potenziale di trasferimento, dato dalla differenza di concentrazione della specie chimica da trasferire tra interno ed esterno (conc. esterna maggiore della conc. interna) e inversamente proporzionale alla somma delle resistenze che si oppongono al trasferimento (resistenza alla interfacie liquido/solido, alla superficie batterica o resistenza all’interno dell’aggregato batterico). Queste relazioni sono espresse dalla legge di Fick:

25. Trasporto attivo: è un fenomeno di trasferimento di materia che avviene mediante un apporto energetico da parte del batterio in grado di agire anche contro il potenziale naturale di trasferimento. Il fenomeno biologico che interviene è un trasporto catalitico mediato da enzimi (permeasi) trasportatori, in grado di trasportare le molecole interessate fino al sito interno di reazione. Tali reazioni enzimatiche possono essere descritte mediante la espressione di Monod: Trasporto misto: Analogamente al trasporto passivo esso agisce favorito da un potenziale di trasferimento dc/dy in grado di attivare una diffusione fisica attraverso le membrane ma spesso la velocità rilevata è maggiore di quella relativa alla sola diffusione. È stato provato che in questo caso interviene, oltre al fenomeno diffusivo, anche un trasporto enzimatico attivo del tipo già visto. va=velocità di trasporto attivo; c=conc. specie chimica all’esterno; vamax=vel. massima per unità di area; ksa=costante di saturazione enzima/specie chimica

26. Le forme di trasporto attivo e misto si rilevano generalmente nei riguardi delle molecole più grosse e più complesse stericamente alcune delle quali, prima di potersi legare all’enzima trasportatore devono essere spezzate in molecole più piccole dagli enzimi idrolitici extracellulari che il batterio stesso estromette nelle immediate vicinanze della membrana esterna. Quando la specie chimica che deve reagire è stata trasportata all’interno della cellula, a livello del sito di reazione biochimica vera e propria, la velocità di reazione di scomparsa della suddetta specie è descrivibile in termini di reazione enzimatica con l’espressione di MichaelisMenten: vr=velocità di reazione enzimatica; V=volume del sito di reazione; vamax=vel. massima per unità di volume di sito; C’=conc. della specie chimica nel sito di reazione

27. Energia La crescita e la sopravvivenza dei microorganismi dipende dalla loro possibilità di ottenere energia e materiali dall’ambiente circostante. Gli organismi viventi hanno a disposizione solo due fonti di energia: l’energia solare e le ossidazioni chimiche; le alghe utilizzano la prima fonte e sono dette autotrofe, mentre la maggior parte dei batteri utilizza la seconda ed ottiene l’energia dal metabolismo dei composti organici ed inorganici; sono perciò chiamati organismi chemiotrofi. Poiché il materiale organico negli scarichi è stabilizzato per ossidazione, questa reazione risulta di grande importanza. Batteri ed altri organismi, nei sisterni di depurazione sia aerobi che anaerobi degli scarichi, non ossidano il materiale attraverso la azione diretta dell’ossigeno, ma piuttosto attraverso uno schema indiretto di rimozione enzimatica dell’idrogeno; questi, attraverso molti passaggi intermedi, reagisce con l’ossidante finale (od accettore di idrogeno) che può essere O2, C, S, N2.

28. Gli organismi litotrofi, che si trovano solo tra i batteri, ottengono la loro energia dall’ossidazione di riducenti inorganici come zolfo o ferro per mezzo di ossidanti (accettori di idrogeno inorganici), come O2 e CO2 mentre gli organismi organotrofi ossidano donatori di idrogeno organici, usando come ossidanti accettori di idrogeno sia organici che inorganici. La fermentazione aerobica è un’ossidazione che produce energia, nella quale l’ossidante finale è un composto inorganico, O2; mentre la fermentazione anaerobica è una ossidazione che produce energia, in cui l’ossidante finale è prevalentemente organico e sia il riducente che l’elemento nutritizio sono prevalentemente organici. Nella tabella seguente è riportato un esempio di riducenti ed ossidanti utilizzati nei vari tipi di fermentazioni batteriche.

29. Riducenti ed ossidanti nelle fermentazioni batteriche

32. I batteri anaerobi utilizzano così come ultimo accettore di idrogeno l’ossigeno legato, il carbonio, l’azoto e lo zolfo, che trovano nelle molecole del sub­strato circostante. A seconda della loro specificità metabolica essi si dividono in: riduttori di composti organici; produttori di metano; riduttori di solfati; riduttori di nitrati e nitriti. I batteri riduttori di composti organici rigenerano i loro coenzimi principalmente per mezzo dell’ossigeno legato, in special modo, dagli zuccheri che ne sono i più ricchi. I prodotti finali di un metabolismo di questo tipo sono costituiti da acidi, aldeidi, chetoni, alcooli. I batteri produttori di metano sono una categoria poco conosciuta del tutto particolare. Essi rigenerano i coenzimi utilizzando unicamente il carbonio come accettore finale di idrogeno. Pare che il metabolismo di questi microorganismi ignori la parte di substrato costituito da zuccheri e proteine e metabolizzi solo gli acidi organici, più o meno prontamente secondo la lunghezza delle catene. Sotto questo aspetto si può riconoscere l’importanza del meccanismo di preparazione attuato dai batteri del primo tipo, cioè dei produttori di acidi.

33. Un tempo si pensava che l’atomo di carbonio che va a formare il metano provenisse dall’anidride carbonica; pare invece che il metano originato per riduzione dell’anidride carbonica sia solo il 30% del totale ed in ogni caso la reazione non avvenga direttamente, ma tramite carbossilazione degli acidi e successive riduzioni degli stessi. Il seguente schema di reazione fondamentale indica comunque che la maggior parte del metano proviene dagli acidi volatili. CH3COOH  CH4 +CO2 Un atomo di carbonio è l’accettore finale di idrogeno e produce il metano, mentre l’altro atomo di carbonio va a costituire l’anidride carbonica. In ogni caso questa non è una reazione unica, ma piuttosto il frutto di una catena di trasporto enzimatica dell’idrogeno ancora sconosciuta. I batteri riduttori di solfati (es. desulfovibrio) riducono i solfati con produzione di acido solfidrico che, se presente in sufficienti quantità, si manifesta con la emanazione di uno sgradevole odore di uova marce. La presenza di questi batteri dipende notevolmente dal contenuto in zolfo o solfati dello scarico. I batteri denitrificanti riducono i nitriti ed i nitrati con produzione di azoto gassoso.

34. Finora, si è visto come viene rimosso l’idrogeno e qual è il suo utilizzo, ma non come questo complesso meccanismo di reazioni ossidative riesca a fornire energia al batterio. L’idrogeno legato alle molecole organiche possiede una certa energia, detta energia di legame. Quando esso viene rimosso, si libera l’energia che prima era impegnata a tenerlo unito agli altri atomi della molecola. Contemporaneamente, poiché l’idrogeno non può restare libero, ma viene trasportato dalla catena enzimatica, esso si lega nuovamente con altri atomi, impiegando però solo una parte dell’energia prima liberata, con un netto guadagno da parte del microorganismo. La ripetizione della rottura e della formazione dei legami fornisce continue frazioni di energia. Il batterio può raccogliere e conservare questa energia ritrasformandola in energia chimica di legame solo tramite due importanti coenzimi, l’ADP (adenosindifosfato) e I’ATP (adenosintrifosfato). L’energia liberata durante il trasporto dell’idrogeno viene così a trasformarsi in energia del legame fosfato tramite l’unione di una molecola di fosfato inorganico all’ADP: ADP + PO43- +18 kcal  ATP

36. Oltre al meccanismo di trasporto dell’idrogeno esistono altre reazioni metaboliche che forniscono energia ma, in ogni caso, da qualsiasi fonte provenga l’energia chimica che il batterio riesce ad ottenere, essa viene trasformata in ATP. In questo modo i carboidrati, i grassi e le proteine sono solo i combustibili grezzi, usati per generare un combustibile di alta qualità, l’ATP, che è l’unica forma di energia che la cellula batterica è in grado di utilizzare direttamente per mettere in moto tutti i suoi meccanismi vitali. Nella fermentazione aerobica l’ambiente deve essere perciò mantenuto rigorosamente aerobico tramite ossigenazione artificiale, cosicché la sostanza organica contenuta nell’acqua possa subire una parziale ossidazione dovuta alla respirazione batterica; i suoi principali costituenti, carboidrati, grassi e proteine, vengono così sottoposti alla deidrogenazione, prima attraverso le singole vie di degradazione (glicolisi-ossidazione, ecc.) ove si ottengono molte molecole di coenzimi ridotti e poi attraverso il ciclo di Krebs, o via metabolica dell’acido citrico, il quale è un intermedio comune e passaggio d’obbligo di quasi tutte le molecole organiche, ove oltre ai coenzimi ridotti si ha la produzione di CO2.

37. Si noti infine che la resa energetica per mole di sostanza organica è molto più alta per il metabolismo aerobico che non per quello anaerobico: a titolo di confronto si riportano i seguenti esempi per il glucosio. Aerobiosi C6H12O6+6O2 6CO2+6H2O + 686 kcal/mole Anaerobiosi denitrificazione 5C6H12O6+24KNO3 30CO2+18H2O+24KOH+12N2 +570 kcal/mole fermentazione metanica C6H12O6 3CO2 + 3CH4 + 34,4 kcal/mole

38. Sintesi La sintesi è il processo mediante il quale un batterio produce i materiali necessari alla sua crescita e, dal momento che si moltiplica per scissione binaria, anche per la riproduzione. Siccome il materiale protoplasmatico è di tipo organico, in particolare ricco di atomi di carbonio, è necessario che i batteri siano in grado di sintetizzarlo: gli autotrofi, lo possono fare utilizzando molecole inorganiche, principalmente CO2, gli organotrofi, invece, possono utilizzare solo molecole organiche. Per protoplasma batterico si intende tutto l’insieme dei componenti chimici costituenti il batterio: ovvero, per la maggior parte, C, H, O, N, e alcuni elementi quali: P, S, Na, K, Ca, Mg, Fe, Mo, Co, Mn, Zn, Cu. Tutti questi atomi costituiscono i mattoni necessari alla costruzione delle macromolecole biologiche di cui necessita il microorganismo; principalmente grassi, carboidrati, proteine ed acidi nucleici, ma in primo luogo H2O. Tali composti organici macromolecolari vengono prodotti all’interno delle cellule dalle reazioni biochimiche le quali, sfruttando l’energia ottenuta col catabolismo e trasformata in ATP, ne attuano la sintesi a partire da piccole molecole di composti semplici presenti nel mezzo acquoso preventivamente degradati per via enzimatica soprattutto per idrolisi, una reazione che ha la funzione di ridurre grosse molecole polimeriche in monomeri.

40. Mentre le fonti di azoto possono essere varie (NO3, NO2, NH3, N organico) a seconda del tipo di metabolismo batterico, il fosforo è sempre richiesto come fosfato inorganico. Le proporzioni in cui tali elementi sono richiesti variano al variare della velocità di crescita, in particolare sono alte in fase di crescita attiva (N=12% del secco totale) e più basse invece man mano che ci si avvicina ai livelli di respirazione endogena (N=5% del secco totale). Le proporzioni BOD5 : N : P possono valere, per condizioni di intensa velocità di crescita, e perciò alto carico organico: BOD5 : N : P=l00 : 5 : l mentre per condizioni endogene si può porre: BOD5 : N : P=200 : 5 : l Tali rapporti sono in genere largamente soddisfatti nel caso di liquami civili, mentre sono deficienti in alcuni casi di scarichi industriali. Si provvede allora a calcolare tale deficit ed a colmarlo immettendo nello scarico sali di N e di P in genere, come NH4+ e PO43- evitando di usare i nitrati poiché facilmente vanno soggetti a denitrificazione e produzione di N2 gassoso che disturba la fase di sedimentazione. L’azoto può essere alimentato come gas (NH3 anidro), come soluzione ammoniacale, o come sale d’ammonio secco ed il fosforo come fosfato mono o diammonico, monosodico o trisodico.

41. Se confrontiamo l’ATP prodotto per respirazione aerobica con quello prodotto per fermentazione anaerobica da una mole di glucosio, vediamo che la respirazione aerobica produce 5 volte più ATP che non la fermentazione anaerobica. Siccome la quantità di energia usata per formare una certa quantità di protoplasma non dipende da come l’energia viene ottenuta, più ATP viene prodotto da un substrato e più materiale cellulare si forma. Ne deriva che in condizioni anaerobiche il carbonio disponibile nel substrato utilizzato per la sintesi cellulare è minore che non in condizioni aerobiche.

42. Stechiometria I calcoli stechiometrici sono fondamentali per una valutazione teorica dei prodotti di partenza e di risulta di un processo batterico, quali la quantità di substrato reagito, la quantità di cellule prodotte, la quantità di ossigeno, azoto e fosforo necessarie alla crescita batterica, la quantità di prodotti ottenuti nonché la quantità di energia scambiata e il calore sviluppato. Dalle stesse reazioni è possibile inoltre, tramite sempre un bilancio di massa, calcolare l’efficienza delle reazioni. L’unica informazione che non è possibile ottenere è un’indicazione della velocità con la quale si compiranno le reazioni per cui non è possibile sapere se le reazioni andranno a compimento in un secondo, un’ora o un giorno. È inoltre evidente che le reazioni che coinvolgono substrati specifici, ad esempio solo glucosio o glicina ecc., sono di significato unicamente didattico, poiché in realtà i substrati con i quali ci si scontra sono spesso miscugli eterogenei di zuccheri, grassi, proteine di produzione ignota. Di fatto tali miscele verranno indicate con le formule brute Cx, Hy, Oa, Nz, Pb e si intende che siano biodegradabili.

43. Deve essere inoltre chiaro che tali reazioni non descrivono assolutamente la realtà delle reazioni biochimiche che intervengono ma hanno l’unico significato di un bilancio di massa. Per operare calcoli stechiometrici occorre stabilire la formula chimica che identifica sia il substrato che la cellula. Entrambe le formule sono generalmente empirche e si ricavano dall’analisi elementare del substrato/cellula. La tabella seguente riporta esempi di formule cellulari.

45. Ripartizione catabolismo/anabolismo

46. La base per le valutazioni teoriche è l’assunzione che una mole di ATP fornisce l’energia per la sintesi di circa 10 g di cellule. Possiamo ora valutare, a titolo di esempio, i coefficienti di crescita batterica y (g batteri prodotti/g substrato utilizzato) o altri rapporti di significato analogo come ad esempio fs (g carbonio destinati alla sintesi batterica/g carbonio totali utilizzati) per una fermentazione aerobica del glucosio e una fermentazione metanogena anaerobica dello stesso. Fermentazione aerobica Catabolismo (energia) C6H12O6 +6O2 6 CO2 +6 H2O +38 ATP Anabolismo (sintesi) 5 C6H12O6 + 6 NH3 6 C5H7O2N + 18 H2O Peso di cellule producibili da ogni mole di glucosio catabolizzato: Pcell=NATPPATP Dove: Pcell=peso di cellule producibili da ogni mole di glucosio catabolizzato (g cell/mole Gc); NATP=numero di moli di ATP producibili da ogni mole di glucosio catabolizzato; PATP=peso di cellule prodotte da ogni mole di ATP utilizzato. Da cui: Pcell= 38  10 = 380 (g cellule/g mole Gc)

47. La quantità di glucosio necessaria per produrre 380g di cellule è ricavabile dalla reazione dell’anabolismo assumendo che il rapporto tra le moli è uguale al rapporto tra i coefficienti stechiometrici. (Gs/PMG):(Pcell/PMcell)= nG : ncell Gs=(nGPMGPcell)/(ncellPMcell)=(5180380)/(6113) = 504 g Il coefficiente di crescita cellulare y sarà: y=Pcell/(Gs+Gc)=380/(504+180)=0.56 La frazione di glucosio necessaria rispetto al totale è: fs= Gs/(Gs+Gc)=504/(504+180)=0.74

48. Fermentazione mista acido metanogena Catabolismo (energia) C6H12O6 3 CH4 +3 CO2 +5.5 ATP Anabolismo (sintesi) 5 C6H12O6 + 6 NH3 6 C5H7O2N + 18 H2O Peso di cellule producibili da ogni mole di glucosio catabolizzato: Pcell=NATPPATP=5.5 10= 55g cellule/mole Gc Gs=5  180  55/(6 113)= 73g glucosio fs=73/(73+180)= 0.29 y=55/(180+73)= 0.22

49. Si può ora scrivere la formula globale della sintesi e dell’energia sottraendo al catabolismo la quota di substrato destinata all’anabolismo.

50. Cinetica biologica.