Kloniranje embrijev živali

1. Kloniranje embrijevživali TEHNIKE ZGODOVINA

2. Zgodovina ne predstavlja samo znanstvenike, ki so klonirali živali, temveč tudi izkušnje in uspešnost postopkov. Razvoj znanja ni potekal na splošno kontinuirano in linearno, pač pa po časovnih intervalih. Zgodovinski pogled omogoča vpogled v različne znanstvene metode, ki so se razvijale paralelno. Ne samo to, predavatelj lahko poda tudi druge poglede in vplive (sociološki), skupaj z drugimi, ki jih je drugače težko predstaviti.

3. ZGODOVINA KLONIRANJA ŽIVALI Hipoteza: ”Vsi geni, ki so prisotni v dednini somatske celice organizma imajo zapis, ki omogoča celosten razvoj organizma. Geni v jedru jajčeca omogočajo popolno regeneracijo osebka”. 1938 Princip kloniranja z prenosom jedra je bil podan s Speemanom.

4. Prednosti so v prenosu vsebine somatske celice odraslega osebka.

5. Hipoteza: ”Vsi geni, ki so prisotni v dednini somatske celice organizma imajo zapis, ki omogoča celosten razvoj organizma. Geni v jedru jajčeca omogočajo popolno regeneracijo osebka”. 1938 Princip kloniranja z prenosom jedraSpeemanom. ČLOVEK DOMAČI SESALCI DVOŽIVKE 1952 Briggs in King Razvoj prenešenega jedra do stadije preblastule v oocitah dvoživk. Razvoj embrijev do stadija blastule. PRENOS JEDRA LOČITEV BLASTOMER DELITEV EMBRIJEV

6. Embrionalno kloniranje so raziskovalci povezali preko treh paralelnih poti: - razrez embrijev, - ločitev blastomer, - prenos jedra. Leto 1997 lahko označimo kot leto začetka embrionalnega kloniranja.

7. ? ? DOMESTIFICIRANI SESALCI RAZREZ EMBRIJEV LOČITEV BLASTOMER 1977 Markert in Petters Z mikromanipulacijo je pridobil dvojni monozigoti kot predhodnici mišjega in kunčjega embrija v stadiju 2 do 8 celic. 1980 Willadsen Ločitev v stadiju 2 celic blastomere. Blastomere je ločil vsebino od zone pellucide in jih obdal z cilindričnim agarjem. Cilinder je obdal oviduct ligature ovac. Embriji v oviduktih se razvijajo do stadija blastule, ki pa so prenešeni v recipientno žival. 1981 Ozil Rojstvo dvojčkov, telet pridobljenega iz delov embrija v stadiju blastule. 1982 Ozil Poenostavi metodo rezanja embrijev v stadiju blastule. V tem stadiju ni tako pomembna vloga zone pellucide. 1995 Johnson Ločitev blastomer v 4 celičnem stadiju, na kulturah “in vitro” do stadija blastule. Blastociste implantiral v recipientke in dobil 4 teličke genetsko identične. Ta tehnika ne omogoča rojstvo trojčkov.

8. LJUDJE DOMAČI SESALCI PRENOS JEDRA 1975 Bromhall transplantacija jedra embrionalnih celic zajca v neoplojeno jajčno celico. V kulturi je pridobil je 4 embrije v stadiju 18-26 celic. LOČITEV BLASTOMER 1979 Shettles prvi prenos jedra iz celice ljudi iz spermatogonija v jajčno celico brez jedra. Pridobil je embrij razvit do stadija morule. DELITEV EMBRIJEV 1983 McGrath in Solter Prvič opisan primer uspešne metode za izmenjavo dednine mišjih embrijev v 1 celičnem stadiju. 1986 Willadsen je pridobil prvič 3 ovce, 8 celičnem stadiju, iz oocit brez jedra je vnesel dednino. 1987 Prather in sod. prvo tele pridobljeno z jedrnim prenosom. 1988 Stice in Robl oocite II zajca.

9. ? PRENOS JEDRA ČLOVEK 1989 Ameriška raziskovalna ekipa objavi, da je sklonirala 8 telet. 1990 Houdebine uspel proizvesti embrij psa v stadiju morule, nato pa ga je zamrznil. 1993 L’INRA dobili 5 kloniranih telet. 1993 Stillman in Hall prvo klniranje človeka v ZDA kar je povzročilo številne emocionalne odzive javnosti. 1996 Wilmut rojstvo Megan in Moragpustila sta v celični kulturi embrije 9 dni do začetka diferenciacije celic. 1997 Wilmut rojstvo Dolly iz somatske celice mlečne žleze ovac. 1997 Wilmut rojstvo Polly klonirano iz diferencirane celice. To je prvo rojstvo individuma iz diferencirane celice in prvi klon, ki je vseboval človeški gen. TEHNIKA

10. EMBRIONALNO KLONIRANJE Z PRENOSOM DEDNINE PRI GOVEDU • OSNOVA. Princip kloniranja temelji na prenosu dednine od donatorja, v recipienta, pridobitev oocit brez dednine, ločitev na blastomere in rekonstrukcijo embrijev.

11. EMBRIONALNO KLONIRANJE S PRENOSOM DEDNINE PRI GOVEDU • POSTOPKI • Pridobitev oocit. • Enukleacija oocit. • Priprava blastomer. • Rekonstitucija embrijev. • Kultura “in vitro”rekonstituiranih embrijev. • Postopki z embriji. • Transplantacija v recipientke - krave. • Začetek novega ciklusa kloniranja.

12. PRIDOBITEV OOCIT • Pridobitev jajčnikov v klavnici in prenos v medij s temperaturo 35°C. • Punktacija foliklov z antrumom. shema ovarija • In vitro kultura pri 39°C, oocite foliklov ostanejo 24 ur v mediju z hormoni, da dosežejo primerno zrelost. sestava medija kulture • Pridobitev oocit II. shema mejoze Folikel z antrumom - votlino Oocite Ovarij Zona pellucida Globularno polarno telo Kromosomi Citoplazma Membrana Oocita II

13. ENUKLEACIJA OOCIT • Prodor v notranjost oocite z mikropipeto. • Izsesanje genetskega materiala (kromosomi + globularno polarno telo) brez poškodbe membrane. REGULACIJA membrane plasmique Globularno polarno telo Kromosomi Mikropipeta Zona pellucida Citoplazma Membrana Oocita II Enukleacija Enukleirana oocita

14. PRIPRAVA BLASTOMER • Izbira spolov : selekcionirane moški in ženske • Superovulacija ženskih živali. Postopki za superovulacijo • Umetna osemenitev. Technika umetne osemenitve • Spiranje embrijev (6 dni po IA ), v stadiju morula (32 - 64 nediferencirane celice). Razvoj embrija • Poškodba zone pellucide z delovanjem encimov. • Ločitev blastomer. Zona pellucida Blastomera Embriji (Morula) Donatorka Uničenje zone pellucide I A embrijev Ločevanje blastomer

15. RECONSTITUCIJA EMBRIJEV • Vstavitev blastomere skozi zono pellucido enukleirane oocite. • Fuzija membran dveh celic z električno stimulacijo. • Doseči moramo normalen razvoj jedra v citoplazmi oocite. Elektro-stimulacija Zona pellucida Blastomera Membrana Zona pellucida Dednina Fuzija membran Rekonstitucija embrija Enukleusna oocita

16. CELIČNA KULTURA “IN VITRO” REKONSTITUIRANIH EMBRIJEV • Prenos rekonstituiranih embrijev v celično kulturo. Zakaj je potreben prenos v kulturo ? • Razvoj embrijev do stadija blastociste (6-7 dneh). Različne celične kulture • Pridobitev reknstituiranih embrijev . Delež rekonstituiranih embrijev Rekonstituirani embriji (1 celični stadij) Blastociste

17. Transplantacija v kravo “prenašalko” z tehniko embriotransferja. UPORABA EMBRIJEV Tehnika transplantacije • Pridobitev klona govedi, ki so genetsko identični. • Nov ciklus kloniranja. Prednosti zamrzovanja • Zamrzovanje. Morula Blastociste Transplantacija Zamrzovanje Recikliranje Genetsko identična teleta = KLONI

18. Enukleacija Pridobitev oocit EMBRIOANLNO KLONIRANJE Z PRENOSOM DEDNINE PRI GOVEDU Ovarij Kultura Oocita II Enukleirana oocita Rekonstituiran embrij K L O N Pridobitev embrijev Vnos Morula Fuzija membran Ločitev Blastomere Donatorka Transplantacija Zamrzovanje embrijev Blastociste Recikliranje Morula

19. Oocita II 5 dni Enukleacija Vnos Elektrofuzija ROJSTVO DOLLY Ovca z svetlo glavo Ovca s temno glavo Biopsija mlečne žleze Superovulacija pridobitev oocit II Celična kultura mlečne žleze Zaustavitev celičnega ciklusa v točki G0 Enukleirana oocita Reconstitucija embrija Dolly Reimplantacija v uterus ovce s črno glavo. Implantacija v oviduktu ovce s črno glavo. Razvoj embrija v 6 dneh.

20. Oocita II Genetska modifikacija: vnos človeškega gena za modifikacijo sinteze proteina, ki je zanimiv za farmacevtsko industrijo. Enukleacija Vnos Elektrofuzija Zgodovina ROJSTVO POLLY Ovca s svetlo glavo Ovca s črno glavo Superovulacija oocite II Diferenciacija celic v celični kulturi Enukleirana oocita Identifikacija celic, ki so integrirane v genski konstrukt. Rekonstituiran embrij Polly, ki izloča sintetizirani človeški protein zanimiv za farmacevstko industrijo Prenešen v ovco s črno glavo.