植物基因组DNA的制备
植物基因组DNA的制备. 及纯度分析. 概述. 不同生物（植物、动物、微生物）的 基因组DNA的提取方法有所不同；同种 生物的不同种类或同一种类的不同组织 因其细胞结构及所含的成分不同，分离 方法也有差异。在提取某种特殊组织的 DNA时，必须参照文献和经验建立的相 应提取方法，以获得可用的DNA大分子。. 实验目的： 掌握常用的植物基因组DNA的制备 和纯度分析方法。. AxyPrep 基因组DNA小量试剂盒. 实验原理：
植物基因组DNA的制备
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植物基因组DNA的制备 及纯度分析
概述 不同生物（植物、动物、微生物）的 基因组DNA的提取方法有所不同；同种 生物的不同种类或同一种类的不同组织 因其细胞结构及所含的成分不同，分离 方法也有差异。在提取某种特殊组织的 DNA时，必须参照文献和经验建立的相 应提取方法，以获得可用的DNA大分子。
实验目的： 掌握常用的植物基因组DNA的制备 和纯度分析方法。
AxyPrep 基因组DNA小量试剂盒 • 实验原理： 本试剂盒采用独特的裂解和蛋白酶 K 消化技术，结合DNA 制备膜选择性地吸附DNA 的方法达到纯化基因组DNA 的目的。每次制备可获得多至20μg 的基因组DNA。用于PCR、Southern 印迹分析、RAPD、RFLD 等分子生物学实验。
一、试剂盒组成、贮存、稳定性 • Miniprep column：小量制备管。室温密闭贮存。 • RNase A： 50 mg/ml，室温保存。 • Buffer C-L：裂解液，室温密闭贮存。 • Proteinase K: 冻干的蛋白酶K 可室温贮存6个月，长时间保存请置于4℃；溶解后，在2-8℃可贮存2个月，长时间保存请勿置于室温中。 • Buffer PK：蛋白酶K 溶解液，室温密闭贮存。 • Buffer P-D: 蛋白去除液，室温密闭贮存。 • Buffer W1: 洗涤液，室温密闭贮存。 • Buffer W2 concentrate：去盐液。使用前，按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇，混合均匀，室温密闭贮存。可用100%乙醇或95%乙醇。 • Eluent：2.5 mM Tris-HCl，pH 8.5，室温密闭贮存。
二、注意事项 Buffer C-L、Buffer P-D 和Buffer W1 含刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套 和眼镜，避免沾染皮肤、眼睛和衣服， 谨防吸入口鼻。若沾染皮肤、眼睛时， 要立即用大量水冲洗，必要时寻求医疗 咨询。
三、实验准备 • 1. 第一次使用时，在Buffer W2 concentrate 中按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇并混合均匀。 • 2. 根据瓶上标签将蛋白酶K溶解于Buffer PK 中，请勿旋涡振荡。 • 3. 准备56℃水浴。 • 4. 使用前检查Buffer C-L是否有沉淀析出，若出现沉淀，请于37℃水浴加热至沉淀完全溶解后再使用。 • 5. 将Eluent或去离子水加热至65℃有利于基因组DNA的充分洗脱。
四、操作步骤 1.取0.3g新鲜植物的嫩叶，剪成小块放入研钵中；加入液 氮，使组织冷冻完全后，快速、用力研磨至粉末状。研磨 时应间断加入液氮以防止组织融化，研磨充分后将研钵放 入56℃水浴至样品粉末刚开始融化。 * 样品研磨应充分，否则严重影响基因组DNA 的得率。 2. 加入700 μl PBS 和2μl RNase A 贮存液，用力碾磨30 s。 3. 转移700μl 研磨好的匀浆至2 ml 离心管中，如匀浆体积不足700μl，补充PBS至700 μl。
4. 加入150μl Buffer C-L和20 μl Proteinase K。 立即漩涡振荡 1min 混合均匀。短暂离心后,将离心 管置56℃水浴 10 min。 * 不要将Proteinase K直接加到Buffer C-L中。 * 富含纤维的根/茎等组织或富含淀粉、蛋白质的种 子等样品，可延长水浴时间至30 min。 5. 加入350 μl Buffer P-D，漩涡振荡 30s 混合均 匀，12,000×g 离心10 min。
6. 将DNA制备管置于2 ml 离心管中，将步骤5中的混合液 移至制备管中，12,000×g离心1 min。 7. 弃滤液，将制备管置回到原来的2 ml 离心管中，加入500 μl Buffer W1，12,000×g离心1 min。 8. 弃滤液，将制备管置回到原来的2 ml 离心管中，加入700 μl Buffer W2，12,000×g离心1 min，以同样的方法，用 700μl Buffer W2 再洗涤一次。 * 确认Buffer W2 concentrate 中已按试剂瓶上指定的体积加入无水乙醇。 * 再次用Buffer W2 冲洗能确保盐份被完全清除，消除对酶切反应的影响。
9. 弃滤液，将制备管置回原来的2 ml 离心管中， 12,000×g 离心1 min。 10.将DNA 制备管置于另一洁净的1.5ml 离心管 中，在制备管膜中央加50μl Eluent 或去离子 水，室温静置1 min，12,000×g 离心1min 洗脱 DNA。 * 将去离子水或Eluent 加热至65℃将提高洗脱效率。
基因组DNA用途 • 对进行遗传多样性分析 • 建立植物系统发育树、分析其亲缘关系 • 亲缘关系的鉴定 • 分子标记在植物种的鉴定中的应用
植物基因组DNA的纯度分析（电泳法） 一、实验原理： 以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳广泛应用于核酸研究中， 其操作简单、快速，是分离、鉴定、纯化DNA的标准方法。 DNA分子在高于其等电点的pH溶液带负电荷，在电场中向 正极移动。DNA分子在电场中通过凝胶介质而泳动，除电荷 效应外，还有凝胶介质的分子筛效应，也就是说与分子大小 构象有关。实验表明DNA迁移率与其分子量的对数成反比。 因此通过参比已知标准分子量的DNA迁移率，可测定样品 DNA的分子量。用低浓度的荧光物质，插入性染料溴化乙锭 （EB）使凝胶中DNA区带染色，在紫外光下可直接显示 DNA在凝胶中的位置，灵敏度很高，可检出10ng（10-9g） 或更少的DNA含量。
二、实验材料、仪器及试剂 1、材料： 植物DNA 2、器材：水平电泳槽、 紫外电泳检测仪或凝胶成像系统、电泳仪、 移液管 、微波炉 3、试剂： （1）T ris-HAc(TAE)缓冲液 A．浓缩的贮备液（50倍）每升含：242gTris 57.1ml冰醋酸，100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。 B．使用浓度：0.04mol/L Tris-HAc/0.04mol/L EDTA。 （2） 琼脂糖：电泳级。 （3）溴酚蓝甘油溶液（0.05%溴酚蓝-50%甘油溶液）：先配制0.1%溴酚蓝水溶液，然后取1份0.1%溴酚蓝溶液与等体积的甘油混合即成。 （4）已知分子量的标准DNA（λDNA-ECORI/Hind III）。 （5） 10mg/mL溴化乙锭水溶液（EB）或GV水溶液。
三、操作方法 1．琼脂糖凝胶板的制备 称取0.7g琼脂糖置于三角瓶中，加入100mlTAE缓冲液，在 沸水浴中加热至琼脂糖完全溶解，冷却至50℃，然后加入EB 溶液使终浓度为0.5μg/ml。倒入凹形有机玻璃槽（事先用 胶带封住有机物玻璃板的边缘）。使其成2mm左右的凝胶板。 在其未凝固前将样品槽模板（梳子）插入凝胶的一端，注意 梳齿底与凝胶底之间应至少保持0.5-1.0mm的凝胶。待全部 凝固后（室温，约30-45分钟），取出梳子及除去胶带，将 凝胶板与玻璃板一起放入电泳槽内，加入TAE缓冲液使刚好 超过凝胶面约1mm。
2．加样：将样品与溴酚蓝按5：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。2．加样：将样品与溴酚蓝按5：1的比例混合，用移液器缓慢加入凝胶样品孔中，点样量为每孔5μgDNA。 3．电泳：点样端接负极，电泳开始时，可用较高的电压， 如100伏特，这样可使样品很快进入胶内，而减少样品扩 散，待样品进入胶内即可保持每厘米5伏特左右的电压，DNA 在电泳中向正极移动。当溴酚蓝的区带移至距凝胶底部1- 2cm，停止电泳，当胶板为10-15cm的长度时，电泳时间一般 为2小时左右。 4.观察与鉴定：电泳结束后，取出凝胶板，在波长为254nm 的凝胶成像系统下，观察电泳图谱，如果电泳条带清晰(如 果EB染色看到桔黄色荧光条带，GV染色则看到绿色荧光条 带)，将凝胶照相。根据标准DNA的电泳图谱，可以得知样品 DNA的分子大小。
思考题 影响所提取的DNA质量的因素有哪些？