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霍乱的实验室检测

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  1. 霍乱的实验室检测

  2. 古典生物型 小川型 Ogawa (AB) O1群 稻叶型 Inaba (AC) 埃尔托生物型 彦岛型 Hikojim (ABC) 霍乱弧菌 霍乱病原菌 O139群(Bengal) 非O1群 O2-O200群 腹泻病原菌 霍乱概述 • 什么是霍乱? 霍乱是由01群和0139群霍乱弧菌(V.cholerae)引起的急性肠道传染病,发病急、传播速度快、波及范围广、危害严重的甲类传染病。

  3. 致病物质 毒素 霍乱肠毒素(CT):前噬菌体基因编码 小带联结毒素Zot 增加肠黏膜通透性 副霍乱肠毒素Ace 肠段积液 侵袭力 鞭毛 菌毛:acf、tcpA

  4. CT的结构 由1个A亚单位和5个B亚单位构成的多聚体,不耐热。 (前噬菌体基因编码) B亚单位:与小肠粘膜上皮细胞GM1神经节苷脂受体结合; 1A+5B

  5. 所致疾病:烈性肠道传染病霍乱 传染源:病人/无症状带菌者,人是霍乱弧菌的唯一易感者 传播途径:粪-口途径 流行特征:地方性、季节性。

  6. 霍乱典型临床特征 患者出现上吐下泻,泻出物呈“米泔水样”。 并发症有血容量减少,循环衰竭及肾功能衰竭,导致尿闭、电解质、酸碱平衡失调导致肌肉痉挛。

  7. 免疫性 感染后可获牢固免疫力;再感染少见 局部黏膜免疫;抗菌抗体(O);抗毒素抗体(B) O1群与O139群不存在交叉免疫保护作用。

  8. 病原体 O1群,O139群霍乱弧菌 • 发病特征: 剧烈腹泻、呕吐、严重脱水时致酸中毒、循环衰竭而致死亡 不治疗或医疗很差的条件下病死率可达到20-50%(重症病人达70-100%) • 培养特性: 营养要求不高,兼性厌氧,37℃生长,怕酸嗜碱, pH:7.4-9.6快速生长 • 检验依据: WS 289-2008 《霍乱诊断标准》 霍乱防治手册(1999年第五版)

  9. 霍乱的实验室检测 • 样品的采集和运输 • 不同样品的病原分离流程及技术要点 粪便 水体 水产品,食品等 • 平板分离及可疑菌落挑取 • 菌落鉴定 • 常用快速检测方法 胶体金检测条 荧光PCR检测 • 检测工作中应关注的事项

  10. 样品的采集和运输 • 采集: • 病例:粪便、肛拭子、呕吐物 未使用抗生素之前 • “健康”人:粪便、肛拭子 • 其他传播环节的标本:食物、水、环境类样品…… • 监测:水样,水产品等 • 运输: 一般要求在3小时内室温(20-25 ℃ )条件下送达实验室检测 • C-B运输培养基(pH8.4); (或文腊二氏保存液) •  碱性蛋白胨水(pH8.4-9.2):不是最佳的,尤其6小时内还不能进行培养时,尽量采用 C-B运输培养基。

  11. 粪便分离流程及技术要点 • 粪便的采集与保存运送 以采集病人自然排除的新鲜粪便为主,水样便采取1~3mL,成形便采取指甲大小的粪量,亦可用直肠棉拭或采便管由肛门插入直肠内3~5cm处采取,采集后的样品应尽快挑取接种于碱性蛋白胨水(PH8.6-9.2),同时划线分离选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板),如不能在6小时内送达实验室检测的样品,应插入Cary-Blair二氏半固体保存培养基(或文腊二氏保存液)中送检。标本与保存液比例约为1∶5。 • 分离培养要点(两管三板法): 挑取粪便,直接接种于碱性蛋白胨水(第一管)中,同时划线分离选择性平板(庆大/四号/TCBS平板,第一板)。 第一管碱性蛋白胨水在37 ℃增菌6-8小时,沾取菌膜下表层液体,划线分离选择性平板(庆大/四号/TCBS平板,第二板),同时吸取0.1~0.2 ml表层培养物,接种碱性蛋白胨水(第二管)。 第二管碱性蛋白胨水增菌18小时后划线分离选择性平板(庆大/四号/TCBS平板,第三板)。

  12. 水体分离流程及技术要点 • 水体的采集与保存运送 水体的采集一般用无菌的500ml水样瓶采集相对静止的表层水(深度为 30cm以内)500ml,密封加盖后于室温(20-25 ℃ )3小时内送达实验室检测。 • 分离培养要点(十倍浓缩碱胨水增菌培养法): 取450ml水样,用1M 氢氧化钠调整至pH 8.4-9.2。然后加10倍浓缩碱性胨水50ml。再加入1%亚碲酸钾0.25~0.5 ml和1000单位/ ml青霉素1 ml。37℃培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板)分离培养,同时吸0.1~0.2 ml表层培养物转种于碱性胨水管中作二次增菌,37℃培养6~8h再划线接种于选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板)。

  13. 水产品分离流程及技术要点 • 水产品的采集与保存运送 通常选取活的或者新鲜的水生动物为采集对象,有时也应考虑冰冻的水生动物,有条件的采样点可将水生动物整体采回实验室再进行相关处置 涂抹采集: 使用无菌棉签涂抹5只以上水水生动物表面、腮部及泄殖腔,直接接种到20ml碱性蛋白胨水作为增菌液处理。 整体或局部采集: 在实验室应以无菌操作将其解剖,取鳃部和肠内容物25克剪碎后,置灭菌均质杯或均质袋中,加入225mL倍体积的碱性蛋白胨水增菌;但小贝壳类动物,则用锤子将外壳击碎,整体放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌;甲壳类动物除含肉质部分外,其余部分(包括鳃、肠、足、表层外壳等)整体放入100ml三角瓶中,加入5-10倍的碱性蛋白胨水增菌。 • 分离培养(两管两板法): 接种后的碱性蛋白胨水37℃培养过夜,取菌膜下表层培养物接种选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板).同时吸0.1~0.2 ml表层培养物转种于10ml碱性胨水管中作二次增菌,37℃培养6~8h再划线接种于选择性培养基(庆大/四号/TCBS平板)。

  14. 平板分离及可疑菌落挑取 • 可疑菌落挑取 经典的鉴定步骤要求每个平板应挑取5个以上可疑菌落,转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面待分纯培养后,再进行O1、O139群血清玻片凝集试验,鉴于对霍乱疫情应急处理的考虑,现大多数监测实验室一般采用将血清玻片凝集试验前置的做法,作为快速筛查的手段,直接对平板上生长的单个可疑菌落进行玻片凝集试验,出现明显凝集时可做初步报告,对平板上出现可疑凝集的菌株必须马上转种于克氏双糖斜面或者普通琼脂斜面,待纯培养物生长良好后再次进行玻片凝集试验加以确证。 庆大霉素平板和4号琼脂:多呈半透明状,菌落中央常呈灰色或灰黑色,并随培养时间的延长而加深(由于这类培养基均含有亚碲酸盐成份)。 TCBS(硫代硫酸盐枸櫞酸盐胆盐琼脂):菌落生长呈黄色发亮、表面光滑、润湿、稍凸起、边缘整齐。 (TCBS平板生长的菌落不能直挑取进行玻片凝集试验,需按经典方法进行纯培养后再进行玻片凝集试验)

  15. TCBS 平板培养菌落形态(呈黄色)

  16. 霍乱弧菌在庆大培养基上菌落形态。(菌落呈现无色 、圆形半透明、湿润、扁平或稍突起、边缘整齐,由于亚碲酸钾的作用,菌落中央常呈灰色或灰黑色)

  17. O139型霍乱弧菌在4号平板和TCBS上的菌落形态O139型霍乱弧菌在4号平板和TCBS上的菌落形态

  18. 菌落鉴定 • 染色镜检 革兰染色阴性的短杆菌 • 血清凝集试验: 分别使用O1群,O139群霍乱血清进行凝集试验,同时使用生理盐水进行对照凝集,以排除与生理盐水发生凝集的自凝菌。 生理盐水不凝集,O1群血清明显凝集的菌落,进一步使用稻叶型和小川型血清进行凝集试验,判定型别:稻叶型血清凝集而小川型血清不凝集的菌落为稻叶型,小川型血清凝集而稻叶型血清不凝集的菌落为小川型,如稻叶型血清和小川型血清均出现凝集的时候,要注意鉴别是否为彦岛型,需进行试管凝集试验且两者的凝集效价均超过一半以上才能判定为彦岛型,因为某些小川型菌落自身会带有少量的C抗原而出现与稻叶型血清发生弱凝集,因此如小川型血清凝集较稻叶型血清凝集有明显优势时应维持小川型的判定。 生理盐水不凝集,O139群血清明显凝集的菌落,一般为O139群,但其与O22群及O155群甚至一些非霍乱弧菌会出现交叉凝集,由上级实验室进行进一步确认。

  19. O1群和O139群抗原构造与血清分型

  20. 国内商品化的霍乱检测血清 • 国外血清:日本生研,泰国S&A血清等

  21. 进一步实验 粘丝试验 0.5%去氧胆酸钠水溶液 氧化酶试验 1%盐酸对氨基二甲基苯胺或盐酸二甲基对苯二胺水溶液

  22. 进一步实验 • 生化鉴定 生化鉴定管: 发酵葡萄糖、甘露醇、 蔗糖、产酸不产气 能分解色氨酸 赖氨酸、鸟氨酸脱羧酶(+) 精氨酸双水解酶(-) 霍乱弧菌生化鉴定管(11种生化,套装,环凯); 生化鉴定条:梅里埃API 20E鉴定条等 全自动生化检测仪检测:梅里埃VITEK2 COMP 全自动生化鉴定卡等 • 进一步分型鉴定(省CDC进行) 噬菌体分型 PFGE脉冲场分型

  23. 霍乱快速检测技术的应用 • 针对原始样品(如病人粪便)以及初始增菌后的菌液进行快速检测 • 胶体金快速检测卡 O1群霍乱胶体金标记快诊卡 O139群霍乱胶体金标记快诊卡 • 荧光PCR快速检测试剂盒 O1群、 O139群双色荧光检测试剂盒 霍乱CTX毒力基因荧光检测试剂盒 注:快速检测并不能替代常规检测的进行,只是作为辅助检测的一种手段

  24. 霍乱弧菌胶体金免疫层析检测

  25. 荧光PCR检测霍乱弧菌 病例标本检测 环境和食品调查的初筛方法 O1群、 O139群双色荧光检测试剂盒 深圳生科源生物技术有限公司

  26. 标本(粪便等) 直 第二次 增菌 (碱胨水) 胶体金、 荧光PCR 快速诊断 增菌培养(碱胨水) 6-8小时 接 分离培养 庆大霉素、4号、TCBS琼脂 10-20小时 玻片凝集阳性 (结合菌落、菌体形态) 凝集菌落或可疑菌落 初步报告 纯培养 (营养琼脂或克氏双糖培养) 10-20小时 O1群和O139群霍乱弧菌的检验程序 鉴定 分型 确诊报告

  27. 检测工作中应关注的事项 • 生物安全与个人防护(生物安全2级实验室操作,做好个人防护,整个培养流程产生的实验培养废弃物和均应进行高压灭菌消毒) • 培养基的配备与质量控制(是否新鲜,含量、PH值、保存条件是否达标,分离平板、血清、生化鉴定等检测试剂质量是否满足要求,是否在有效期内使用等) • 可疑阳性结果的及时规范上送(当出现可疑阳性菌株时,要第一时间进行分纯并进一步对分纯物进行血清学确认,应上送分纯后的培养物而不是初始平板!!) • 做好样品的相关登记记录。 谢 谢