1 / 15

Solujen pakastus (varastointi)

Solujen pakastus (varastointi). Osa soluista varastoidaan tulevaa käyttöä varten Rajallinen kasvupituus  täytyy säilöä Soluterapiassa varastoidaan valmiiksi karakterisoitu linja (master cell bank), josta sulatellaan eriä hoitokäyttöön Estetään muutoksia genotyypissä ja transformaatiota

bunme
Télécharger la présentation

Solujen pakastus (varastointi)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Solujen pakastus (varastointi) • Osa soluista varastoidaan tulevaa käyttöä varten • Rajallinen kasvupituus  täytyy säilöä • Soluterapiassa varastoidaan valmiiksi karakterisoitu linja (master cell bank), josta sulatellaan eriä hoitokäyttöön • Estetään muutoksia genotyypissä ja transformaatiota • Säilötään ennen senescenssiä, ”nuoria” soluja käyttöön • Estetään muutoksia solun toiminnassa • Pakastetaan nestetyppeen • -196oC • DMSO:ta, seerumia ja mediumia • DMSO = cryoprotectant  estää jään muodostumista solun sisälle • Sulatetaan ampullit nopeasti ja laitetaan kasvatusalustalle

  2. Kontaminaatiot • Solujen hyvät kasvatusolosuhteet otollisia myös mikro-organismeille • Bakteerit • Hiivat • Sienet • Mykoplasma (pahin kontaminoija, koska vaikea havaita ja päästä eroon) • Voidaan välttää steriilillä työskentelyllä ja lisätyillä antibiooteilla • Soluterapiatuotteissa myös eläinperäiset materiaalit (xenogeneous) • Eläinperäinen seerumi (fetal calf/fetal bovine) • Feeder solut, esim hiiren endoteelisolut • Kasvutekijöiden tai vasta-aineiden valmistuksessa siirtyneet eläinperäiset proteiinit (Neu5Gc)  riski immunivasteen syntymiselle.

  3. Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) • GXP järjestelmät • GMP = Good Manufacturing Practice • GLP = Good Laboratory Practice • Viitataan lääketuotannossa edellytettyihin formaalisiin laatujärjestelmiin, joiden soveltamisala ja sisältö on määritetty lainsäädännössä

  4. Soluterapiatuotteiden kasvatus (GMP) • Esimerkkejä GXP-järjestelmien edellyttämistä osa-alueista • Organisaatiokaavion ja vastuun määrittäminen • Tarkat toimintaohjeet työvaiheille • Laadunvalvontaan liittyvät testit ja analyysit • Materiaali, tuote, tuotantoympäristö • Toimintojen dokumetointi • Täydellinen jäljitettävyys • Toiminnot, lähtömateriaali, työntekijät jne.

  5. Kantasolujen kasvatus erilaisiin soluterapiatarpeisiin • Alkion kantasolut • Sydäninfarkti • Sydänlihassolujen erilaistus ja karakterisointi • Aikuisen kantasolut • Mesenkymaaliset kantasolut • Luuvaurion korjaus • Osteoblastien erilaistus ja karakterisointi

  6. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • Sydäninfarkti aiheuttaa yleensä laaja-alaisen sydänlihassolujen tuhon ja tilalle muodostuu sykkimätön arpikudos  sydämen toiminta heikkenee • Aikuisen sydänlihassolujen uusiutumiskyky on erittäin huono  kantasoluterapia • Alkion kantasoluista sydänlihassoluja  toiminta paranee • hMSCs ja immunomodulaatio  ei synny yhtä isoa arpikudosta  toiminta paranee

  7. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • END-2 menetelmä: • END-2 solujen (visceral endodermal cells) maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle • Erilaistumattomien ihmisen alkionkantasolujen leikkaaminen END-2 solujen päälle. • EB (embryoid body)-menetelmä: • Erilaistumattomien hESC leikkaaminen suspensioon • 20 % FBS medium koko kasvatuksen ajan • EB:ien kasvatus 4-10 päivää suspensiossa  maljaus gelatiini päällystetylle kuoppalevylle.

  8. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa Hiiren endodermaalisten solujen (END-2) maljaus gelatiini-päällystetylle pinnalle Erilaistumattomien alkion kantasolukolonioiden mekaaninen leikkaaminen Palat suspensioon jossa mukana 20% FBS  Embryoid Body Palat END-2 solujen päälle, ilman seerumia. Kasvatus 4-10 päivää suspensiossa Maljaus gelatiini-päälystetylle maljalle Kasvatus 9-20 päivää Sykkivien alueiden havainnointi Sykkivien alueiden havainnointi

  9. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa • Lääkeainekokeilut: - Ylärivillä perustaso - 0.017 mg/ml isoprenalin - 14.3 mg/ml esmolol - 25 mg/ml esmolol • Johtavuus: - sykintä alkaa elektrodista a - etenee b:n kautta c ja d d a c

  10. Alkion kantasolut sydäninfarktin hoidossa: Yhteenveto • Erilaistumistehokkuudet yleisesti ottaen matalia • Suuri vaihtelevuus eri kertojen välillä • Karakterisoinnit • Sydänlihassolun kaltaisia • Troponin T sarkomeerirakenne • Cd-43, Nkx2.5, • Elektrofysiologiset ominaisuudet vastaavien fysiologisten sydänlihassolujen kanssa • Erilaistettuja soluja voitaisiin käyttää tulevaisuudessa esim. soluterapian kehittämsessä ja lääkeaine/toksikologia testauksissa • Varsinaisiin soluterapiahoitoihin riittävän solumäärän saavuttaminen vaikeaa • Lisäksi pitäisi saada puhdas sydänlihassoluviljelmä • Eroon erilaistumattomista hESCs  teratoma

  11. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa • Mesenkymaaliset kantasolut erilaistuvat in vitro osteoblasteiksi • Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid • 2-5 viikkoa • Ilmenee morphologian muutoksina, ALP aktiivisuuden nousuna, kalsiumin mineralisaationa, kollageeni tyypin I expressiona ym. • Sovellutuksia suurten luuvaurioiden hoidoissa joko erilaistumattomina tai in vitro erilaistettuina yhdessä Scaffoldien ja kasvutekijöiden kanssa

  12. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Potilaan luuydinnäyte Ficoll eristys  mononukleaariset solut Solujen maljaus muovialustalle Kasvatetaan solumäärää muutaman passagen verran Erilaistumattomat kantasolut Dexamethasone, b-glycerophosphate, ascorbic acid 3-5 vkoa Erilaistuneet osteoblastit - ALP aktiivisuus - mineralisaatio - tyypin 1 kollageeni

  13. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa 3 viikon erilaistumisjakso  ALP aktiivisuuden määritys

  14. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa Genomisen DNA:n metylaatioasteen muuttuminen 3 viikon erilaistumisjakson jälkeen

  15. Mesenkymaaliset kantasolut luuvaurioiden hoidossa • Mesenkymaalisten kantasolujen luuerilaistaminen in vitro on jo rutiininomaista • Pystytään tuottaan merkittäviä määriä osteoblasteja • Vrt. Sydänerilaistumisen tehokkuuteen • Erilaistettuja soluja käytetty kliinisissä kokeissa

More Related