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重组质粒的转化

重组质粒的转化. 一 . 实验原理. 1. 概念. 感 受 态 细 胞. 在自然条件下 , 很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内 , 但在人工构建的质粒载体中 , 一般缺乏此种转移所必需的转移基因 , 因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需 将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。. 转 化.

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重组质粒的转化

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Presentation Transcript

  1. 重组质粒的转化

  2. 一. 实验原理 1. 概念 感 受 态 细 胞 在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般缺乏此种转移所必需的转移基因,因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源 DNA 分子进入的细胞，称感受态细胞。

  3. 转 化 转化(Transformation)是将外源DNA分子引入受体细胞,使之获得新的遗传性状的一种手段,它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术。

  4. 2. 转化过程 • 转化过程所用的受体细胞一般是限制修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变体(Rˉ,Mˉ),它可以容忍外源DNA分子进入体内并稳定地遗传给后代。 • 受体细胞经过一些特殊方法(如电击法,CaCl2 ,RbCl(KCl)等化学试剂法)的处理后,细胞膜的通透性发生了暂时性的改变,成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞(Compenent cells)。 • 进入受体细胞的DNA分子通过复制,表达实现遗传信息的转移,使受体细胞出现新的遗传性状。 • 将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子(Transformant,即带有异源DNA分子的受体细胞)。

  5. 3.常用的感受态细胞制备方法 • RbCl(KCl)法， CaCl2法，电击感受态制备等 • RbCl(KCl)法制备的感受态细胞转化效率较高,但制备较复杂 • 电击感受态细胞转化效率高,但需电击仪 • CaCl2法简便易行,且其转化效率完全可以满足一般实验的要求,制备出的感受态细胞暂时不用时,可加入占总体积15％的无菌甘油于-70℃保存(半年),因此CaCl2法为使用更广泛.

  6. 4. CaCl 2法制备感受态细胞原理 CaCl2法基本原理是：细胞处于 0 ～ 4 ℃， CaCl2低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的 DNA 形成抗 DNA 酶的羟基 - 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经 42 ℃ 90 秒热激处理，促进细胞吸收 DNA 混合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（ Amp r）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含 Amp 的选择性培养基上， 倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。

  7. 5. 提高转化效率的几个因素 1） 感受态细胞的状态： 制备感受态细胞时不要用经过多次转接或储于４℃的培养菌，最好从－70℃或-20℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。 细胞生长密度以刚进入对数生长期时为好，可通过监测培养液的OD600来控制。DH5α菌株的OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右(不同的菌株情况有所不同),这时比较合适。密度过高或不足均会影响转化效率。

  8. 2） 质粒的质量和浓度: 用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态DNA(cccDNA)。 转化效率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比,但当加入的外源DNA的量过多或体积过大时,转化效率就会降低。1ng的cccDNA即可使50μl 的感受态细胞达到饱和。 一般情况下,DNA溶液的体积不应超过感受态细胞体积的5％。

  9. 二. 材料，设备及试剂 1）材料　　低温保存的感受态细胞：由E. coli DH5α菌株制备； 质粒DNA: 实验室保存 2）设备 　　恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪， eppendorf管等。

  10. 3. 试 剂 1.LB液体培养基： 称取蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(Yeast extract) 5 g，NaCl 10 g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5, 加去离子水至总体积1升,高压下蒸气灭菌20分钟。2. LB固体培养基： 液体培养基中每升加12g琼脂粉,高压灭菌后制备平板。 　　 3.Amp母液： 氨苄青霉素(Ampicillin, Amp)母液：配成 100mg/ml水溶液, -20℃保存备用。 4.含Amp的LB固体培养基: 将配好的LB固体培养基高压灭菌后冷却至60℃左右,加入Amp母液,使终浓度为100ug/ml, 摇匀后制备平板。

  11. 三. 操作步骤 本实验将CaCl2法处理好的E.coli DH5a感受态细胞, 与质粒共保温,实现转化。由于质粒带有氨苄青霉素抗性基因(Ampr )，可通过Amp抗性来筛选转化子。 如受体细胞没有转入质粒，则在含Amp的培养基上不能生长。能在Amp培养基上生长的受体细胞（转化子）肯定已导入了质粒。转化子扩增后，可将转化的质粒提取出，进行电泳、酶切等进一步鉴定。

  12. 1) 取200μl感受态细胞悬液,在冰浴中使其解冻分装，每份含50ul。 2) 加入3μl质粒DNA溶液 ，轻轻搅拌均匀，冰上放置20分钟。 3) 42℃水浴中热击90秒,热击后迅速置于冰上冷却3分钟。 4) 向管中加入1ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5) 将上述菌液摇匀后取适量涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 热激转化

  13. 对照组1: 以同体积的无菌水代替DNA溶液,但涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。证明感受态细胞的活性。 对照组2: 以同体积的无菌水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 证明感受态细胞没有其它杂菌的污染。 对照组的设置

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