1 / 26

Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen

Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen. SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT). Überblick. Einführung Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen Grundlagen Kryokonservierung Der Einfriervorgang

calista-kennedy
Télécharger la présentation

Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Kryokonservierung humaner embryonaler Stammzellen SABT1 Masterstudiengang Biotechnologie Hanna Lorig Betreuerin: Julia Schulz (Fraunhofer IBMT)

  2. Überblick • Einführung • Embryonale, adulte und induzierte Stammzellen • Grundlagen Kryokonservierung • Der Einfriervorgang • Kryoprotektiva: „Frostschutzmittel“ • Kryobanken: Lagerung der Zellen • Kryokonservierung von hESC • Fallbeispiele • Probleme • Ausblick Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  3. Einführung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  4. Stammzellen I Embryonale Stammzellen (ESC)[1] • Besitzen mindestens zwei Eigenschaften: • selfrenewal durch asymmetrische Zellteilung • Pluripotenz Fähigkeit, sich in alle Zellen der drei Keimblätter zu differenzieren (Ecto-, Endo- und Mesoderm) • Entdeckung murine ESC (1981), humane ESC (1998), Induzierte pluripotente Stammzellen (IPS) (2006/07)[2] • Gewinnung aus der inneren Zellmasse von Blastozysten • Regulierung der Forschung in Deutschland über das Embryonenschutzgesetz Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  5. Stammzellen II Adulte Stammzellen • im Allgemeinen geringeres Selbsterneuerungsvermögen • eingeschränktes Differenzierungspotential (Multipotenz) • Während der gesamten Lebensdauer zu finden, v.a. in Organen wie Knochenmark, Haut, Leber, Nabelschnur(blut), etc. IPS – Induzierte pluripotente Stammzellen • Adulte Stammzellen, die durch Reprogrammierung in pluripotente Stammzellen umgewandelt wurden • bis dato ist die absolute Übereinstimmung mit ESC nicht eindeutig bestimmt Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  6. Stammzellen III Abb. 1: Überblick IPS/ Differenzierung [15]

  7. Gewinnung & Kultivierung ESC • Gewinnung aus der inneren Zellmasse der Blastozyste • Zerstörung der Trophoblasten durch Laserstrahl/Antikörper • Kultivierung [3]: • FeederzellenMonolayer (inaktivierte murine embryonale Fibroblasten) • Koloniewachstum -> 3D Struktur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  8. Forschungsziele • Grundlagenforschung der molekularen Mechanismen (z.B. Differenzierung) • Klinische Forschung • Zell- und Gewebeersatz • Immunsystemaufbau (HIV) • Krankheits- und Patientenspezifische Behandlung • Zellmodell für toxikologische/ pharmakologische Untersuchungen Lagerung und Bereitstellung von hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  9. Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  10. Grundlagen Verfahren für das Lagern (Einfrieren) von Zellen in lN2 • Der Einfrierprozess • Langsames vs. schnelles Einfrieren • Zellschäden durch extra- und intrazelluläre Eisbildung • Kryoprotektiva als Frostschutz • (im)permeable Substanzen • Lagerung der Zellen in Kryobanken • Vorschriften, Handling und Qualitätskontrolle [16] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  11. Der Einfriervorgang Zwei Einfriergeschwindigkeiten: • Langsam (Kristallisation) Wässrige Lösung gefriert unter Phasentrennung, wobei es zur Aufkonzentration der gelösten Stoffe kommt (Gefrierkonzentration)  Eutektisches Verhalten • Schnell (Vitrifikation) • Extrem schnelle Abkühlung, die zur sog. Glasbildung führt z.B. direkter Kontakt mit lN2  Übersättigte Lösung • unkontrolliertes Einfrieren Abb. 3: kristalline Mannitstruktur (links), amorphe Saccharosestruktur (rechts) [3] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  12. Kristallisation Verhalten von Zellsuspensionen bei kristallinem Eis dendritisches Wachstum der extrazellulären Wasserphase der Lösung  Schädigungen der Zellen v.a. durch extrazelluläre Effekte [14] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  13. Vitrifikation Zelleffekte bei Vitrifikation Schnelles Abkühlen führt zu intrazellulärer Eisbildung (flash out Effekt) • Schädigungen der Zellen durch intrazelluläre Eisbildung aufgrund von iceseeding durch Membranporen Zwei-Faktor-Hypothese (Mazur et al.) [6]: Abb. 4: Schema der 2-Faktor Hypthese von Mazur Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  14. Kryoprotektiva Stoffe, die positive Effekte auf die Überlebensrate während des Einfrieren ausüben  Verbreiterung des optimalen Kühlratenbereichs Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  15. Kryobanken Internationaler Forschungsfortschritt bedingt die Registrierung, Lagerung und Verwaltung von biologischem Material (UK StemCell Bank, HUES, …)  Ziel: metabolisch inaktiver Zustand, der Langzeitstabilität garantiert • Verschiedene Möglichkeiten der Konservierung [7]: Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  16. Kryokonservierungvon hESC Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  17. Vorbereitung • mechanische Dissoziation in Klumpen von 50-200 Zellen • Enzymatisches Ablösen der Zellen (hESC zusammen mit Feederzellen) • 10 – 20 Zellklumpen pro Kryosubstrat • Auswahl der geeigneten Abkühlrate • Resuspensionder Zellen in geeignetem Kryomedium [18] [17] Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  18. Kryoprotokolle • Kontrolliertes Einfrieren Probe wird mithilfe eines Einfrierautomaten kontrolliert eingefroren • Kühlrate variierbar • Schrittweises Abkühlen möglich • Reproduzierbare Protokolle • Unkontrolliertes Einfrieren Probe wird direkt in Gefrierschrank/ lN2 überführt  Vitrifikation Probe wird direkt in LN2 gefroren Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  19. Fall 1: Medium + 10 %DMSO Controlled-rate freezingofhESC[8] Kryomedium: 90% Kulturmedium + 10 % DMSO Kryosubstrat: 0,25 ml CassouStraw Kontrolle: I) ohne Kryokonservierung (Probe A) II) unkontrolliertes Einfrieren bei -80 °C (Probe B)

  20. Fall 1: Medium + 10 %DMSO Vitalität • Kontrolliertes Einfrieren mit Iceseeding optimal • Höhere Einfrierraten wirken sich negativ auf die Vitalität aus Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  21. Fall 2: Medium + Trehalose ImprovedcryopreservationofhESCwithtrehalose[4] Kryomedium: 90% Knockout serumreplacement+ 10 % DMSO + 0,2 mol/ l Trehalose Kryosubstrat:0,5 ml Kryovial Kühlrate: 1 °C / min auf – 80 °C, nach 12 h in lN2 Kontrolle: 90% Knockout serumreplacement + 10 % DMSO

  22. Fall 2: Medium + Trehalose Differenzierungsstatus: • n = 75 Kolonien • Jüngere Passagen erholen sich besser nach der Kryokonservierung Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  23. Problematik • 3D-Struktur der hESC • Temperatur- & Kryoprotektivumgradienten • Verlust der Pluripotenz nach dem Auftauen • Dissoziation der Zellklumpen kann zu Zelltod führen • Zell-Zellkontakt unterbrochen durch extrazelluläre Eisbildung • Kryoprotektiva • Spezifische Auswahl wichtig • Toxizität bei Raumtemperatur • Proben & Arbeitsweisen • Verschiedene Zelllinien & Passagen • Unterschiedliche Handhabung der Kryokonservierung die optimale Kryokonservierung ist von vielen Faktoren abhängig Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  24. Ausblick • hESC besitzen großes Potential als Forschungsobjekt: • regenerative Medizin • Grundlagenforschung in der Embryonalentwicklung • Individuelles Testsystem für Pharmazeutika • Forschung nach besseren Kryoprotektiva ist weiterhin von großer Bedeutung Kryokonservierung ist ein vielversprechender , aber teilweise noch unausgereifter Ansatz für die Lagerung biologischer Proben Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  25. Dankeschön für die Aufmerksamkeit! Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

  26. Quellen [1]: Human embryonicstemcells, Pera M.F., Reubinoff B., Trounson A., J. Cell. Sci., 2007, 113: 5-10 [2]: Inductionofpluripotentstemcellsfrom adult human fibroblastsbydefinedfactors, Takahashi K. et al., Cell, 2007 Nov 30, 131 (5): 834-5 [3]: EmbryonicStemCellLinesDerivesfrom Human Blastocysts, J.A. Thomson et al., Science, 1998, 282: 1145 [4]: Improvedcryopreservationof human embryonicstemcellswithtrehalose, Chun F. Wu et al., ReproductiveBioMedicine Online, 2005, 11, 6:733 - 739 [5]: The Banking andCryopreservationof Human EmbryonicStem Cells, Charles J. Hunt, Transfusion medicineHemotherapy, 2007, 34: 293-304, [6]: A two-factorhypthesisoffreezinginjury: Evidencefrom Chinese hamster tissue-culturecells, Mazur et al., Experimental Cell Research,1971, 71:345-355 [7]: Biobanking, John G. Day, Glyn N. Stacey, Mol. Biotechnol., 2008, 40:202 - 213 [8]: Controlled-rate freezingof human ES cells, Carol B. Ware, Angelique M. Nelson, Anthony Blau, BioTechniques, 2005, 38:879 - 883 [13]: Ein Mikro-Waageverfahren zur kontinuierlichen Bestimmung der Sublimationsgeschwindigkeit während der Gefriertrocknung, Dissertation Claudia Roth, Universität Erlangen-Nürnberg, 2000 http://www2.chemie.uni-erlangen.de/services/dissonline/data/dissertation/ Claudia_Roth/html/ Dissertation-Roth.html [14]: Cryosurgery, Boris Rubinsky, Annual reviewof Biomedical Engineering, 2000, Vol. 2:157-187 [15]: http://www.sigmaaldrich.com/etc/medialib/life-science/stem-cell-biology/ipsc- pathway.Par.0001.Image.566.gif [16]: http://www.sciencedaily.com/images/2008/09/080910090825-large.jpg [17]: Kryovial, http://www.fisher.co.uk/offers/fisherbrand/images/FB74401.jpg [18]: Kryostraws, http://www.cryobiosystem-imv.com/Portals/3/produits/zooms/Z_CBS_straws.jpg Seminar Masterstudiengang Biotechnologie

More Related