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第四章 柠檬酸发酵机制

第四章 柠檬酸发酵机制. 柠檬酸又名枸橼酸，学名 α- 羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。 性质： 分子式 C 6 H 8 O 7 ，分子量 192.12 有两种形式 水合物： 100℃ 时融解，密度 1.542g/cm3(18℃) 无水物：无色晶体或粉末，熔点 153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚. 用途： 1 ）食品行业 2 ）医药行业 3 ）化工行业 4 ）其它行业 柠檬酸的生产： 1874 年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体； 1913 年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。. 一、柠檬酸合成途径. 氧化脱羧.

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第四章 柠檬酸发酵机制

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Presentation Transcript

  1. 第四章 柠檬酸发酵机制 • 柠檬酸又名枸橼酸，学名α-羟基丙烷三羧酸，是生物体主要代谢产物之一。 • 性质： • 分子式C6H8O7，分子量192.12 有两种形式 • 水合物：100℃时融解，密度1.542g/cm3(18℃) 无水物：无色晶体或粉末，熔点153℃ 有强酸味。溶于水、乙醇和乙醚

  2. 用途： • 1）食品行业 • 2）医药行业 • 3）化工行业 • 4）其它行业 柠檬酸的生产： • 1874年首次从柠檬汁中提出柠檬酸并结晶成固体；1913年首次实现利用黑曲霉发酵生成柠檬酸。

  3. 一、柠檬酸合成途径 氧化脱羧 EMP途径 乙酰-CoA 柠檬酸 葡萄糖 丙酮酸 羧化 草酰乙酸

  4. 1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在EMP途径的所有酶；1953年，Jagnnathan等证实了黑曲霉中存在EMP途径的所有酶； • 1954年，Shu提出葡萄糖分解代谢中约80％走EMP途径； • 1958年，MeDomough等发现黑曲霉还存在HMP途径的酶，但HMP途径主要存在于孢子形成阶段； • 1954－1955年，Ramakrishman和Martin研究发现黑曲霉中存在三羧酸循环；

  5. 葡萄糖 6-磷酸果糖 淀粉 1，6-二磷酸果糖 磷酸丙糖 CO2 磷酸烯醇丙酮酸 丙酮酸 乙酰CoA CO2 CO2 柠檬酸 草酰乙酸 2+ Fe 顺乌头酸 苹果酸 异柠檬酸 富马酸 α-酮戊二酸 琥珀酸

  6. 存在两个CO2固定系统（需Mg2＋、K＋）： • 1）丙酮酸（PYR）在丙酮酸羧化酶作用下，生成草酰乙酸（此作用更强） • 2）磷酸烯醇丙酮酸（PEP）在PEP激酶的作用下，生成草酰乙酸

  7. 碳平衡和能量平衡 3/2O2 3H2O 9ATP 9ADP 2H2 2ATP 2ADP 2×C3H4O3 C6H12O6 EMP途径 丙酮酸脱羧 CO2固定 C4C2缩合 C6H8O7 柠檬酸 H2O

  8. 二、柠檬酸生物合成的代谢调节 • （一）、糖酵解及丙酮酸代谢的调节 • 1、正常情况下，柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶有抑制作用，而AMP、无机磷、铵离子对该酶则有激活作用，特别是还能解除柠檬酸、ATP对磷酸果糖激酶的抑制作用。 • 铵离子浓度与柠檬酸生成速度有密切关系，正是由于细胞内浓度升高，使磷酸果糖激酶对细胞内积累的大量柠檬酸不敏感。

  9. 淀粉 葡萄糖 6-磷酸果糖 AMP Pi ATP 1，6-二磷酸果糖 + 磷酸丙糖 NH4 CO2 磷酸烯醇丙酮酸 + K 丙酮酸 乙酰CoA CO2 CO2 柠檬酸 草酰乙酸

  10. 2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。2.比较底物锰充足、锰缺乏时分批培养物的最大活力时发现，锰缺乏时黑曲霉的组成（合成）代谢受损伤，这与柠檬酸的积累有关。 • 锰缺乏时，细胞内NH4＋ 浓度高，Aa浓度高（蛋白合成受阻，导致升高）。因此，锰离子效应是通过NH4＋升高而减少柠檬酸对磷酸果糖激酶的抑制来实现的。

  11. 3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。3.丙酮酸激酶是EMP途径的第2个调节点，在某些真菌得到证实，但黑曲霉未被证实。

  12. （二）TCA循环的调节 • 1、TCA环的起始酶：柠檬酸合成酶是一种调节酶。但在黑曲霉中，柠檬酸合成酶没有调节作用，这是黑曲霉TCA环的第一个特点。 • 顺乌头酸酶失活，阻断TCA环是柠檬酸积累的必要条件，顺乌头酸水合酶需要Fe2＋。顺乌头酸酶、异柠檬酸酶在pH2.0时失活，线粒体顺乌头酸酶在催化时有柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7的平衡，这个平衡可能就是造成柠檬酸的最初积累而使pH值降低。

  13. 2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤）2.第二个特点：黑曲霉菌体内α-酮戊二酸脱氢酶缺失或活力很低（TCA环被阻断），它被葡萄糖和NH4＋抑止。（是TCA循环中唯一不可逆的反应步骤） • 3.氧和pH值对柠檬酸发酵的影响很大。 • 氧是发酵过程（EMP途径和丙酮酸脱氢）生成的NADH2重新氧化时所需 • 标准呼吸链产生ATP积累，侧呼吸链不产生ATP，缺氧导致侧呼吸链失活，使ATP积累，柠檬酸积累减少。

  14. CO2 磷酸烯醇丙糖酸 丙酮酸 乙酰CoA CO2 CO2 柠檬酸 草酰乙酸 2+ Fe 顺乌头酸 苹果酸 异柠檬酸 富马酸 α-酮戊二酸 琥珀酸 α-酮戊二酸脱氢酶系 抑制

  15. TCA循环在柠檬酸积累中所起作用可归纳为： • （1）大量生成草酰乙酸是积累柠檬酸的关键 • （2）丙酮酸羧化酶和柠檬酸合成酶基本上不受代谢调节的控制或其控制及微弱，而且这两个反应的平衡保证了草酰乙酸的提供，增加了柠檬酸的合成能力

  16. （3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。（3）TCA循环的阻断微弱，导致循环中间代谢物积累。由于各种酶处于平衡状态，使柠檬酸积累，当柠檬酸浓度超过一定水平时，就通过抑止异柠檬酸脱氢酶活力来提高自身的积累。

  17. 柠檬酸的积累机制归纳： 抑制蛋白合成 ①Mn 2+ ﹢ 缺乏 NH4 解除磷酸果糖激酶的代谢调节，促进EMP途径的畅通 有一条呼吸活力强的不产生ATP的侧系呼吸链 ②由于丙酮酸羧化酶是组成型酶，不被调节控制。

  18. ③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。③丙酮酸氧化脱羧生成乙酰CoA和CO2固定两个反应的平衡，以及柠檬酸合成酶不被调节，增强了合成柠檬酸的能力。 ④由于顺乌头酸水合酶在催化时建立了以下平衡： 柠檬酸：顺乌头酸：异柠檬酸=90：3：7 同时控制Fe2+含量时，顺乌头酸酶活力降低，使柠檬酸积累。

  19. ⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。⑤随着柠檬酸积累，pH降低到一定程度时，使顺乌头酸酶和异柠檬酸脱氢酶失活，更有利于柠檬酸的积累及排出细胞外。

  20. 三、乙醛酸循环和醋酸发酵柠檬酸 • 丙酮酸脱羧反应是不可逆的，草酰乙酸的供给只能由乙醛酸循环来完成 • 存在异柠檬酸裂解酶，合成柠檬酸的C4二羧酸只能由乙醛酸提供。

  21. 乙酸 乙醇 CoA β-氧化 烃类 乙酰CoA 草酰乙酸 柠檬酸 乙酰CoA 苹果酸 异柠檬酸 乙醛酸 富马酸 琥珀酸 乙醛酸循环

  22. 作业： • 简述柠檬酸生物合成的代谢调节

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