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Marcatori molecolari

Marcatori molecolari. Caratteristiche e applicazioni. Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino. I marcatori molecolari Strumento per l’analisi genetica. Strumento  non oggetto di studio Molecolari  biologia molecolare Analisi genetica  studio delle differenze genetiche

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Marcatori molecolari

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Presentation Transcript

  1. Marcatori molecolari Caratteristiche e applicazioni Luca Gianfranceschi e Rosanna Marino

  2. I marcatori molecolariStrumento per l’analisi genetica Strumento non oggetto di studio Molecolari  biologia molecolare Analisi genetica studio delle differenze genetiche Marcatori  approccio indiretto

  3. Alcune definizioni Marcatore genetico:Locus genico che identifica univocamente una regione cromosomica Mappa genetica:Definisce le RELAZIONI LINEARI tra marcatori molecolari E’ IL RISULTATO DELL’ANALISI GENETICA Distanza genetica: Stima della distanza esistente tra due marcatori calcolata sulla frequenza di ricombinazione- Si esprime in Centimorgan (cM)- 1cM = 1 ricombinante / 100 prodotti meiotici Polimorfismo: Presenza di varianti alleliche per un dato gene o marcatore Polimorfismo molecolare:Differenze evidenziabili a livello di DNA

  4. I marcatori molecolari sono UNIVERSALI

  5. I marcatori molecolari sonoEREDITABILI

  6. I marcatori genetici • Marcatori morfologici • Problemi: 1) non sono molto numerosi 2) dipendono dalla specie (ploidia ecc.) • Marcatori molecolari • Identificano polimorfismo a livello di DNA • Offrono la possibilità di coprire tutto il genoma • Sono applicabili universalmente

  7. Marcatore genetico ideale • Non influenzato dall’ambiente • Neutrale • Stabile • Facile da monitorare • Numeroso • Codominante • Polimorfico • Presente in qualsiasi tessuto • Indipendente da sesso ed età • Analisi automatizzabile N.B. Peccato che non ci sia !!

  8. Tecniche per la produzione di marcatori molecolari • Ibridazione molecolare • Southern blot  es. RFLP • Amplificazione del DNA • PCR (Polymerase Chain Reaction) RAPD, SSR o STR • Approcci misti • Digestione enzimatica e amplificazione CAPS, AFLP

  9. I marcatori RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)

  10. La reazione a catena della polimerasi (Polymerase Chain Reaction - PCR) • Inventata da Kary Mullis nel 1985 • Gli è valsa il Nobel nel 1993 Fondamenti: • Conoscenze sulla replicazione del DNA - DNA polimerasi • Sintesi in vitro di DNA a sequenza specifica - Oligonucleotidi • Biologia dei batteri estremofili - DNA polimerasi Taq ricavata da Thermus aquaticus

  11. I marcatori RAPD(Random Amplified Polymorfic DNA) • Basati su PCR • Non sono necessari dati di sequenza • Automatizzabili • Oligonucleotidi (primer) sono corti e di sequenza casuale • Temperatura di annealing è bassa: 37°C • Richiedono poco DNA di partenza • La tecnica è facile Problemi • Scarsa ripetibilità • Non sono locus-specifici • Non sono esportabili • Difficilmente confrontabili tra mappe e tra genotipi • Sono marcatori dominanti

  12. Analisi RAPD di 9 varietà di ciliegio 2000 bp 1500 bp 500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 M I campioni 1 e 3 provengono dalla stessa varietà, così come i campioni 2 e 6; nella corsia 9 è stato usato DNA di amareno

  13. I microsatelliti o SSR(Simple Sequence Repeat)

  14. I microsatelliti o SSR(Simple Sequence Repeat) Individuo 1 Individuo 2 1 2 3 4 5 6 Individuo 3 Individuo 4 Individuo 5 Individuo 6

  15. Analisi SSR di alcuni individui di una popolazione naturale Individui della popolazione 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 - 1 2 3 4 5 + 6 Quanti alleli distinguete negli individui di questa popolazione?

  16. La tecnica degli AFLP

  17. Esempio di gel AFLP

  18. Analisi multiplex di marcatori

  19. Gli SNP(single nucleotide polymorphism) ...C C A T T G A C... …G G T A A C T G... ...C C G T T G A C... …G G C A A C T G... • Che cos’è uno SNP ? • E’ una differenza, o polimorfismo, di un singolo nucleotide nella sequenza di DNA esistente in alcuni individui della stessa specie. • Il loro numero varia notevolmente a seconda della specie • In uomo c’è in media uno SNP ogni 300 nucleotidi

  20. Perché utilizzare gli SNPs • Sono la base molecolare della maggior parte delle differenze tra individui • Possono contribuire alla suscettibilità a malattie e all’adattabilità delle specie • Sono presenti in un elevato numero e sono distribuiti lungo tutto il genoma

  21. Impieghi dei marcatori molecolari • Analisi di paternità • Diagnosi di anomalie genetiche • Analisi forensi • Identificazione di QTL e geni utili • Miglioramento delle specie vegetali ed animali • Studio della struttura, evoluzione e biodiversità delle popolazioni • Studi di epidemiologia • Tracciabilità dei prodotti animali e/o dei GMO • Conservazione della natura • Studi di filogenesi ed evoluzione

  22. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/guide/human/

  23. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/mapview/maps.cgi

  24. Programma di queste esercitazioni • LUNEDÌ • Introduzione sui marcatori molecolari e loro usi • Estrazione del vostro DNA dalle cellule della mucosa boccale • MARTEDÌ • Spiegazione teorica sulla PCR e sull’uso che ne faremo • Amplificazione specifica di tre sequenze del vostro genoma • Marcatore altamente polimorfico D1S80 sul cromosoma 1 • Marcatore Y-GATA-A7.2 sul cromosoma Y • Marcatore HUAMEL sul gene dell’amelogenina sulla regione omologa dei cromosomi X e Y • Preparazione dei gel di agarosio • MERCOLEDÌ • Elettroforesi dei prodotti di PCR sul gel di agarosio • Protocollo semplificato per l’estrazione di DNA da Kiwi • Analisi e discussione dei risultati ottenuti

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