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In vitro 대체시험법을 이용한 화장품 성분의 평가

In vitro 대체시험법을 이용한 화장품 성분의 평가. 건국대학교 이진성 , 최태부. 피부 / 안 자극성 테스트 (Skin/eye irritation test ). Draize test (Rabbit eye irritation test ). Draize score ; 토끼의 눈에 시료물질을 투여한 후 충혈 정도를 관찰 : 화장품의 피부 / 안 자극성 테스트로서 이용되어 왔음 그러나 주관적인 판단과 윤리적인 문제 등으로 인해 사용이 어렵게 되었음 여러 가지 대체시험법이 제시됨

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In vitro 대체시험법을 이용한 화장품 성분의 평가

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Presentation Transcript

  1. In vitro 대체시험법을 이용한 화장품 성분의 평가 건국대학교 이진성, 최태부

  2. 피부/안 자극성 테스트 (Skin/eye irritation test )

  3. Draize test (Rabbit eye irritation test ) • Draize score; 토끼의 눈에 시료물질을 투여한 후 충혈 정도를 관찰: 화장품의 피부/안 자극성 테스트로서 이용되어 왔음 • 그러나 주관적인 판단과 윤리적인 문제 등으로 인해 사용이 어렵게 되었음 • 여러 가지 대체시험법이 제시됨 Hen's egg test-chorioallantoic membrane (HET-CAM) Bovine corneal opacity and permeability (BCOP) Cytotoxicity Cytokine and protein release (skin equivalent)

  4. HET-CAM test • 수용성 성분에 대한 자극성 실험, 육안으로 판정 • Irritancy potential = (301-H) x 5/300 + (301–v) x 7/300 + (301-c) x 9/300 H: Haemorrhage time(s) V: Vasoconstriction time(s) C: Coagulation time(s)

  5. HET-CAM, BCOP scores and cytotoxiciy in vitro of make up removers

  6. Clinical results

  7. Cytotoxicity test • 사용한 세포주: L929(mouse fibroblast), CHO(chinese hamster ovary), HT1080(human fibrosarcoma), human dermal fibroblast (HDF) • 무혈청배지: 기본배지 DMEM/F12 (1:1) + transferrin (10 μg/mL) + ethanolamine (50μM) • 테스트 대상 물질: Draize score가 알려진 계면활성제 15종

  8. Fig.2 Cytotoxicity measurement of various cell line ◇:Polyoxyethylene sorbitan monooleate ◆:Polyoxyethylene sorbitan monolaurate○:Cocconut fatty acid diethanolamide ●:Sodium N-lauryl L-glutamatex:Sodium lauryl sarcosinate * :Sodium lauryl sulfate□:Glycerin ■:PEG 400 △:1,3-Butylene glycol ▲:Proppylene glycol

  9. Table 5. NR 50 scores of each cell-line to 10 chemicals

  10. Table 6. NR 50 score of L929 depending on time

  11. Table 7. Comparison of NR 50 score according to various serum level

  12. Table 8. Comparison of NR scores to 15 chemicals at 2%, 0% serum concentration

  13. NR 50 measurement of Lotion samples supplemented with Tween 60 ○: Lotion + T 60 0.5% : NR50=5.45 (DS20; 758.6) ●: Lotion + T 60 1.0% : NR50=5.09(DS20; 478.6) △: Lotion + T 60 2.0% : NR50=4.70(DS20; 281.8)

  14. 2. 멜라닌 생성 저해 테스트(Melanogenesis inhibition test)

  15. 1. Tyrosinase 효소 저해 능력 사용 효소 및 세포의 종류 - Mushroom tyrosinase - B16 mouse melanoma BL6, F1, F10 - HM3KO human melanoma - TXM13 human melanoma - SK-MEL-31 human melanoma 효소 유전자 발현 억제 - Tyrosinase, Tyrosinase related protein I Dopachrome tautomerase

  16. 2. 멜라닌 생성 속도 측정 • 멜라닌 추출; 흡광도 측정 • DOPA positive melanocyte (in vivo) • 멜라노좀 갯수 측정 (in vivo) • 세포주에 따른 멜라닌 생성 조건 확립 멜라닌 생성 유도; uv irradiation (keratinocyte coculture or conditioned media), alpha-MSH, theophylline, 멜라닌 생성 시기: 3-5 일 혈청농도

  17. 3. 멜라노좀 전달 저해 • Melanocyte-keratinocyte coculture • Melanosome uptake inhibition (keratinocyte) • Actin filament reorganization inhibition (melanocyte)

  18. α-MSH에 의한 tyrosinase 발현 증가 경로 α-MSH cAMP PKA CREB MITF Tyrosinase 〓 PI3-K Rac Rho actin disorganisation dendricity

  19. Effect of melanoston on the production of tryrosinasemRNA, protein, melanin and on the enzyme activity

  20. α-MSH에 의한 B16 세포 형태 변화 (A) Control (B) α-MSH (100 nM) (C) α-MSH (100 nM) Arbutin 136 ㎍/㎖ (D) α-MSH (100 nM) Melanoston 136 ㎍/㎖

  21. Melanoston의 melanin 분비억제효과 (A)Clon-M3 cell (B)Clon-M3 cell + Melanoston (0.001%) (C)Clon-M3 cell + arbutin (0.001%) (A) (B) (C)

  22. Keratinocyte에 의한 melanosome uptake에서 melanoston의 영향 (A) negative control (B) positive control (C) Melanoston : 0.001% (D) Arbutin : 0.001%

  23. In vivo test를 통한 검증

  24. 3. 콜라겐 생성 테스트(Collagen synthesis test)

  25. 콜라겐 합성경로

  26. 콜라겐 합성속도 측정 • 콜라겐 합성 –콜라겐 분해 = 콜라겐 순합성 • Collagen synthesis; - TGF-beta; Smad signaling (ECM) - NO; cGMP signaling (wound healing) - collagen mRNA, MMP-1, 2, 9 mRNA UV irradiation; TGF-beta type 2 receptor Smad signaling cGMP signaling

  27. 1. 세포주 영향 • Cell bank 구축 • 세포주에 따른 영향을 배제하고 일관성 있는 실험 결과를 얻기 위해서는 세포주 은행을 구축 • Master cell bank: 50 ~ 200 vial - Working cell bank를 만드는데 이용 • Working cell bank: 50 ~ 200 vial - 실제 실험에 이용; 매 실험마다 표준품으로 콜라겐 합성능을 재확인

  28. 2. 혈청 첨가 영향 • 혈청의 첨가가 단백질 측정을 어렵게 함.

  29. 3. 배양시간 • 배양시간에 따라 첨가물질의 효과가 바뀔 수 있음: 세포주에 따라 적절한 배양시간 결정

  30. RT-PCR을 이용한 콜라겐 발현측정

  31. Real-time RT-PCR을 이용한 mRNA 정량

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