抗がん剤の細胞膜透過性に対する交流磁界の影響評価

A-15 抗がん剤の細胞膜透過性に対する交流磁界の影響評価 Effect of Extremely Low Frequency Magnetic Fields on Cell Membrane Permeability of Anticancer Drug 金沢大学大学院　自然科学研究科　電子情報工学専攻 2年今井　俊輔

目次 1. 研究背景,目的 2.実験原理・実験対象としての大腸菌・抗がん剤の作用・実験系 3.抗がん剤に対する交流磁界の影響 (1)磁界曝露による抗がん剤の細胞膜透過性への影響評価 (2)異なる分子量の抗がん剤に対する作用増強効果のスクリーニング 4. まとめと今後の課題

研究背景 磁界と化学物質等の複合的環境での影響が報告されている研究報告抗がん剤にパルス磁界を併用することで薬効が増強抗がん剤のみに比べがんの増殖 57%抑制マウスに多剤耐性をもつガン細胞を移植抗がん剤ダウノルビシンを投与パルス磁界曝露併用当研究室において… 抗がん剤シスプラチン、マイトマイシンCについて 60 Hzの交流磁界曝露により作用が2倍程度増強抗がん剤治療に交流磁界が利用できる可能性

抗がん剤 投与量を減らして… 抗がん剤＋磁界曝露併用治療抗がん剤投与(点滴や注射) 患部のガン細胞患部に磁界曝露ガンガンガンガン薬が全身に × × × 患部ダメージ増加投与量を減らし患部では効果を高める正常細胞にもダメージ副作用を軽減全身の正常細胞患部に非接触で磁界を曝露正常細胞正常細胞正常細胞正常細胞効果的な抗がん剤治療法 × ダメージ軽減

研究目的 過去の研究結果から… 磁界曝露により2種類の抗がん剤の作用が最大2倍程度に増強（周波数60 Hz,磁束密度50 mT）交流磁界曝露(周波数60 Hz,磁束密度50 mT)によって・抗がん剤作用のどのプロセスに影響しているのか抗がん剤の種類によって… ・作用が抑制される抗がん剤があるか・増強割合の大小が顕著に見られるのか不明な点が多い (1)抗がん剤作用の膜透過のプロセスでの影響評価 (2)分子量の異なる5種類の抗がん剤での増強効果のスクリーニング

実験対象（大腸菌） とつなげていくヒト細胞 (HeLa cell) 大腸菌(Escherichia coli) モデル化基礎実験→動物実験・・・→臨床応用 http://cellbank.nibio.go.jp/cellbank.html http://microbewiki.kenyon.edu DNA DNAに対してアプローチする抗がん剤（大腸菌などの細菌）（ヒト細胞、マウスなど）どちらもDNAを有し抗がん剤作用を受ける ×2/day ×2/30min 増殖サイクル抗がん剤による細胞増殖阻害作用を観察する上で… 結果が早く得られる大腸菌を用いた

抗がん剤の作用 C C G G DNAにアプローチしDNA複製を阻害することで抗がん効果を得る ⇒ただし種類によって作用機構が違う A A T T C C G G A A T T A A T T G G C C • ②DNA鎖切断タイプ(DNA-strand break) ①DNA結合タイプ(DNA-binding) C C G G C C G G T T A A DNA 鎖 DNA 鎖 DNA DNA 細胞細胞細胞の増殖に必要なＤＮＡ複製を阻害細胞増殖を抑制抗がん効果を得る

実験系 曝露群交流磁界発生装置各時間毎に周波数：60 Hz 磁束密度：50 mT 生菌数測定 Water Circulator (36℃) Coil In Out Sample (Drug + MF) (コロニーアッセイ法) Acrylic case Sample (Drug Only) Coil Coil ±増減 Water Core 大腸菌を対象とし生菌数の増減により抗がん剤の細胞増殖阻害作用を評価 Ciruculation Water クーリングポンプにより一定温度の水を循環恒温環境を同条件にして実験を行う非曝露群生菌数：少　抗がん作用：大磁束密度:3mT程度生菌数：多　抗がん作用：小

抗がん剤の細胞膜透過性に対する交流磁界の影響抗がん剤の細胞膜透過性に対する交流磁界の影響作用増強効果の影響プロセスに関する検討

抗がん剤と細胞膜透過 抗がん作用のどのプロセスに交流磁界が影響しているのかは不明である本研究で用いる抗がん剤はDNAに作用するため細胞内に入って反応する抗がん剤細胞外細胞膜 ①一部の抗がん剤が細胞膜を透過細胞外細胞質細胞内細胞内 DNA ②DNAに作用 ③修復機能が働きDNAを修復 No effect 大腸菌（原核生物）死滅× 一部の抗がん剤は細胞外に残る ①の抗がん剤の細胞膜を透過する量が交流磁界によって変化するかを調べた。

磁界曝露による抗がん剤の細胞膜透過性への影響評価磁界曝露による抗がん剤の細胞膜透過性への影響評価細胞外に残った抗がん剤の作用を調べることにより細胞膜透過性を評価する抗がん剤 +培養液遠心分離機にかける抗がん剤の作用（量）を測定大腸菌＋抗がん剤大腸菌の沈殿 ①交流磁界曝露 ②大腸菌を分離、上澄み液を取り出す曝露群と非曝露群から取り出した上澄み液の作用をそれぞれ比較

実験手順 曝露群 Drug + MF 上澄み液（抗がん剤）を取り出し、新しい培養液に添加遠心分離（大腸菌と抗がん剤を分ける） Coil Coil 0h Core 2 h曝露（60 Hz,50 mT）培養液＋抗がん剤添加非曝露群 Drug Only 0h 遠心分離機 2h後 0h 2h 生菌数測定作用（量）の変化を測定生菌数測定過去に増強効果が得られた抗がん剤マイトマイシンC,シスプラチンを用いた

抗がん剤の細胞膜透過性に対する磁界影響 * ** * ** Data are represented as the mean ±SEM from 6 independent experiments**P<0.01, *P<0.05 to Non-Exposure Fig. 1MMC,CDDPの細胞内の抗がん剤の作用評価 Fig. 2MMC,CDDPの細胞外の作用評価マイトマイシンC(MMC),シスプラチン(CDDP)の抗がん剤作用が増加(Fig.1) 細胞外の抗がん剤作用（上澄み液中）が減少(Fig. 2)（有意差あり）抗がん剤マイトマイシンC,シスプラチン共に細胞膜透過性が増加

抗がん剤の細胞膜透過性に対する磁界影響の考察抗がん剤の細胞膜透過性に対する磁界影響の考察 Table 1　シスプラチンとマイトマイシンCの細胞膜透過性の比較 Data are represented as the mean ±SEM from 6 independent experiments *P<0.05, **P<0.01 to Non-Exposure 周波数60Hz,磁束密度50 mTにおいて非曝露群（Non-Exposure）と比べてマイトマイシンC,シスプラチンどちらも細胞内外の抗がん剤量の増加と減少が相関している(逆数の一致より) 交流磁界曝露による抗がん剤の作用増強が膜透過性の増加によって起こることを示唆

分子量の異なる抗がん剤×交流磁界曝露による影響分子量の異なる抗がん剤×交流磁界曝露による影響作用増強効果のスクリーニング

抗がん剤の影響評価スクリーニングの必要性 抗がん剤に交流磁界曝露を併用する治療法の臨床応用現段階では… ・抗がん剤マイトマイシンCとシスプラチンについては交流磁界曝露により作用が増強される・さらに濃度に依存せず、増強割合は一定であった・曝露条件は周波数60 Hz,磁束密度50 mTで最大の増強割合になった(6 hにおいて) 臨床応用を目指す上で・抗がん剤作用が抑制される抗がん剤はないか・増強割合には種類によって大小があるのか・作用増強効果のメカニズム解明に繋がる抗がん剤の特徴があるか周波数60 Hz,磁束密度50 mTの曝露条件において… さまざまな特性をもつ抗がん剤について磁界による作用増強の有無のスクリーニングを行う

抗がん剤の選択 Table 2　新たに用いる五種類の抗がん剤の特徴・DNAにアプローチするタイプ（マイトマイシンC,シスプラチンと同様）・抗がん剤の分子量,作用機構などが異なる膜透過性に関連がありそうな分子量に着目して5種類を選択特にジノスタチンは今までの抗がん剤と比べ最大10-30倍 6hまでの作用について磁界影響を測定した

大腸菌の細胞増殖に対する磁界影響 109 108 107 106 Fig. 3生菌数-反応時間特性 Fig. 4　生菌数相対比-反応時間特性 Data are represented as the mean ±SEM from 5 independent experiments 曝露群(MF Exposure)と非曝露群(Cell growth)との間に差異はみられない細胞増殖に対する交流磁界の影響はない

異なる分子量の抗がん剤に対する評価 108 107 106 105 104103 108 107 106 105 104103 108 107 106 105 104103 Fig. 6　生菌数-反応時間特性 (MW:1255, 1487) Fig. 7　生菌数-反応時間特性 (MW:15000) Fig.5　生菌数-反応時間特性 (MW:517, 564) Data are represented as the mean ±SEM from 5,6 or 7 independent experiments ・すべての抗がん剤について曝露群が非曝露群と比べ作用が増強・分子量が大きいジノスタチンについても作用が増強されているどの分子量の抗がん剤も磁界によって作用の増強傾向が見られた

抗がん剤作用の増強割合の算出 ブレオマイシン(BLM)の場合 108 0.5 107 6.1mM 106 8.1 mM 6.1mM 105 8.1 mM+MF (10.5 mM) 8.1 mM 104 12mM 8.1 mM+MF Increase 29 % 103 12 mM Data are represented from 6 independent experiments Fig. 8BLMの生菌数-反応時間特性 Fig. 9BLMの生存率-濃度特性(mmol/L) Increase Rate : (Drug + MF の濃度換算/ 実際の添加した濃度)=1.29倍(29%増) IC50 : 細胞数を半分にするのに必要な濃度（生存率が0.5になる時の濃度）=2.2mM 増強割合(Increase rate)と半数阻害濃度 (IC50)　抗がん剤毎に算出

抗がん剤の作用増強割合の比較 Increase 31 % Increase 27 % Increase 35% (a)ミトキサントロン(MW:517) (b)ダウノルビシン(MW:564) (c)アクチノマイシンD(MW:1255) Increase 29 % Increase 3 % (d)ブレオマイシン(MW:1487) (e)ジノスタチン(MW:15000) Fig .10　抗がん剤の生存率-反応時間特性

抗がん剤作用増強のスクリーニング Table 3　五種類の抗がん剤の交流磁界曝露による作用増加割合の比較 Data are represented as the mean ±SEM from 5,6 or 7 independent experiments ・作用機構,半数阻害濃度(IC50値)は増強割合に影響がない・分子量が1オーダー大きいジノスタチンのみ増加割合が著しく小さかった分子量によって抗がん剤作用の増強割合が変化することを示唆

まとめと今後の課題 まとめ・交流磁界曝露により抗がん剤の膜透過性が増加していた →膜透過性の増加により抗がん剤作用が増強されている可能性がある・異なる分子量の5種類の抗がん剤を用いたが、分子量の大きさに関わらず作用が増強する傾向を示し、作用が抑制される抗がん剤は無かった →臨床応用可能性がある・抗がん作用の増加割合に関して、作用機構、抗がん剤作用の強弱(IC50値)に関連はなかったが、分子量が1オーダー大きい抗がん剤のみ著しく小さい値を示した →膜透過以降(DNAに作用するプロセス)の影響はないことを示唆しており分子量の大きさは増強割合に影響する可能性がある今後の課題・次のステップとしてヒト培養細胞での実験を行う

Thank you

細胞膜の構造 細胞質細胞膜 Lipid bilayer (5 nm) 大腸菌（原核生物） Protein molecule Phospholipid molecule DNA Fig .11細胞膜の構造・細胞膜の表面には脂質二重層が広がり所々に膜タンパクが埋め込まれている・細胞膜を透過しなければ細胞質にあるDNAに作用できない・脂質二重層は抗がん剤のような大型の分子は通せない膜タンパクを介して抗がん剤が透過していると考えられる

膜タンパクについて Solute（ion） Solute Hydrophilic pore (a)　運搬体タンパク　 (b)　チャネルタンパク　 Fig .11膜貫通型タンパクの種類・抗がん剤のような大型分子は運搬体タンパクかチャネルタンパクを透過する・チャネルタンパクは主に小型イオンを通すと言われている・多くの大型の栄養物質は運搬体タンパクを通して細胞内に入る ⇒抗がん剤が取り込まれている可能性抗がん剤は運搬体タンパクを通っている可能性が高い

抗がん剤の輸送経路と磁界影響について Anticancer Drug Solute Ion Solute Solute Influenced by ELF magnetic fields? Ion Coupled transporter (a)　ユニポート(Uniport) (b)　シンポート(Symport) (c)　アンチポート(Antiport) Fig .12運搬体タンパクの輸送形態・本実験では対数増殖期（細胞増殖が盛んな状態）で実験を行っているため細胞内に必要な栄養素やイオンを多数取り込んでいる・共役輸送系(特にシンポート系)で抗がん剤が紛れ込んで取り込まれる（栄養物質と分子量が似通っている抗がん剤）可能性が高い・電荷をもつ抗がん剤,イオンが磁界によってローレンツ力を受ける・運搬体タンパクの構造や特性が磁界によって変化,ポアサイズが変わる⇒抗がん剤の取り込みを活性化する

分子量による増強割合の違いについて Anticancer Drug Anticancer Drug Ion ≠ ≠ Ion Coupled transporter (a)　シンポート(Symport) (b)　アンチポート(Antiport) ・共役輸送で栄養物質と一緒に入る場合,ジノスタチンのような大きな分子量(15000)の物質が取り込まれることは少ないため,磁界により作用を受けた抗がん剤が入り込もうとしても,容易に判別され,間違えて取り込まれることが少ない・膜タンパクの構造や特性が磁界によって変化しているとすれば、ポアサイズが変化し分子量(∝分子の大きさ)の違いによって透過率が変わる

作用評価時間について 過去の研究から,6 ,12, 18, 24 hと長時間曝露による影響を調べたが6 h以降磁界曝露による差異が増加することはなかった Fig .3抗がん剤シスプラチンにおける交流磁界の影響

他の研究報告 抗がん剤の細胞膜透過性に関連する報告・パルス磁界曝露(200 Hz,0.5 mT)抗がん剤ドキソルビシンの取り込み量が増加 (ShuichiroO.et.al.,AichiMed,Univ.Assoc,(2007)) ⇒本研究のマイトマイシンC,シスプラチンの取り込み量が増加する結果と類似・交流磁界曝露(50 Hz,2.5 mT)細胞膜の伝導性と誘電率が変化した。細胞質の伝導性は変化がなかった(SantiniM.T,et.al., Bioelectrochemistry and Bioenergetics,(1995)) ⇒細胞質に磁界の影響はないと考えられ、細胞質でDNAに作用するプロセスに影響はないという本研究の見解に関連する細胞膜の特性に関する報告・パルス磁界曝露(50 Hz,1.88 mT)により膜内のタンパク質分布に変化 (Ferdinando,B.at.al.,Intramembrane.,Bioelectromagnetics(1997)) ・交流磁界曝露（50 Hz,40 mT）によって細胞膜の膜タンパクの構造が変化 (Ikehara,T.et.al., Bioelectromagnetics(2003)) ・交流磁界(72 Hz,0.114mT)チャネルタンパクにおけるCa2+の流出量が変化 (C.L.M.BaureusK.,et.al., ,Bioelectromagnetics,(2003)) ⇒磁界曝露による細胞膜の特性や構造の変化,またイオン物質への影響が報告されていることから細胞膜に影響があるという本研究の見解に関連する

他の研究報告2 抗がん剤作用に対する交流磁界の影響

他の抗がん剤の磁界影響 108 107 Increase 47% 106 Fig .3ACR(MW: 848)の生菌数-反応時間特性 Fig .4ACR(MW: 848)の生菌数相対比-反応時間特性 Data are represented as the mean ±SEM from 6 independent experiments ・他の抗がん剤と違い,2 hで薬効が低下する抗がん剤(分子量MW: 848) ・増加割合が1.47倍(47 %増加)となった短時間に作用するタイプの抗がん剤にも増強効果がある

ヒト細胞(真核生物)と大腸菌(原核生物)の違いヒト細胞(真核生物)と大腸菌(原核生物)の違い核膜核膜孔核小体細胞質 DNA リソソーム小胞体リボソームミトコンドリアペルキシオソーム大腸菌（原核生物） DNA ・脂質二重層が二重になっている・DNAがむき出しになっている・脂質二重膜が一重・DNAが核に囲まれている・細胞内が小器官に分かれている（タンパク質の合成、消化器官、エネルギー産出など）抗がん剤の膜透過は大腸菌より容易であると考えられ、ヒト細胞においても交流磁界曝露による影響を受けるのではないか

実験評価方法 コロニーアッセイ法抗がん剤＋大腸菌の菌液磁界非曝露側磁界曝露側抗がん剤のみ抗がん剤+交流磁界曝露の併用磁界曝露菌液を寒天培地に撒く一晩培養… コロニー形成コロニー数＝大腸菌の生菌数コロニー数をカウント生菌数：少　　抗がん作用：大生菌数：多　　抗がん作用：小

交流磁界によるマイトマイシンCの細胞膜透過性に対する影響評価交流磁界によるマイトマイシンCの細胞膜透過性に対する影響評価 (1)異なる磁束密度に対する評価 ** ** Data are represented as the mean ±SEM from 6 independent experiments **P<0.01 to Non-Exposure (a)細胞内に入った抗がん剤の作用 (b)細胞外（上澄み）の作用 Fig. 1　異なる磁束密度に対するマイトマイシンCにおける細胞内外の抗がん剤作用の評価・細胞内の抗がん剤の作用の増強、細胞外での作用の減少がみられる・50,40 mTで顕著な変化が見られた（50 mT有意差あり）

異なる磁束密度に対する細胞膜透過性の比較 周波数60Hzにおいて非曝露群（Non-Exposure）と比べて Table 1　マイトマイシンCの細胞膜透過性の比較 Increase decrease Fig. 2　マイトマイシンCにおける細胞内外の抗がん剤作用の評価・抗がん剤の磁束密度によらず細胞内の抗がん剤作用は増加、細胞外では減少・どの磁束密度に対しても細胞内の抗がん剤の作用と細胞外の作用の増減の割合（逆数）が相関・p-値の比較より磁束密度が大きいほど影響が顕著になっている磁束密度50mTで細胞膜透過性が最大になった

シスプラチンの細胞膜透過性に対する影響評価シスプラチンの細胞膜透過性に対する影響評価周波数60Hz,磁束密度50 mTにおいて非曝露群（Non-Exposure）と比べて * * Table 2　シスプラチンとマイトマイシンCの細胞膜透過性の比較 Data are represented as the mean ±SEM from 6 independent experiments *P<0.05 to Non-Exposure Fig .3　シスプラチンの細胞内外の抗がん剤の作用評価・シスプラチンに関しても細胞膜透過性の増加が見られた(有意差あり) ・マイトマイシンCシスプラチンどちらも細胞内外の抗がん剤量の増減がほぼ一致抗がん剤の作用増強が膜透過性の増加より起こることを示唆

抗がん剤の細胞膜透過性に対する交流磁界の影響評価