輔英科技大學 職業安全衛生系 張淑瑩老師 專題生：呂柏賢 、吳振豐

1. 冷光儀應用於空氣細菌菌落數之測定 輔英科技大學 職業安全衛生系 張淑瑩老師 專題生：呂柏賢、吳振豐 研究目的 菌落總數可以評估職場空氣微生物污染程度和衛生狀況。空氣微生物檢驗常用的檢測方法有兩種：一種是自然沉降法，就是在一定的時間內從空氣中自然沉降方式落入單位面積的微生物個數；另一種是衝擊式採樣法，可檢測空氣中每立方公尺之總菌數(CFU/m3)。衝擊式採樣法能採集懸浮於空氣中的微生物顆粒，並且不受環境氣流擾動之影響，採樣量準確，因此較能準確的測出空氣中細菌的含量，已是我國公認的空氣採樣的首選方法，也是環檢所公告之室內空氣中細菌濃度檢測方法。 ATP冷光儀（ATP luminometer)是用ATP來進行微生物總含量的檢測，其檢測結果是以相對吸光值(relative light unit, RLU）呈現，所需檢測時間約十分鐘，故它不像傳統細菌培養方法要經數天時間才得知結果，現已廣泛使用於職場環境衛生與清潔品質管控。 本專題利用雙頭衝擊式採樣器及ATP冷光儀針對職場空氣細菌數之檢測作標準化模式之研究。利用採樣器同時收集各採樣地點之空氣於兩個培養皿中，一個培養皿經培養後以傳統平板計數算出落菌數，另一個培養皿則以ATP冷光儀測RLU值，利用迴歸方程式求出兩者對數值間的線性關係。此標準線可針對各職場之空氣細菌數進行快速估計，能讓業者即時了解廠區生物性危害的實際狀況，以利衛生安全管控。 理論基礎 腺核苷三磷酸 (Adenosine triphosphate,ATP )存在於動物、植物、細菌、黴菌等生物細胞中，故ATP的含量能用於表示職場空氣中生物性危害的污染物數量。1960年代美國太空總署發展出ATP生物冷光反應技術（ATP bioluminescence technique），用以檢測ATP的含量。此法是一種快速檢測方法，其反應原理與螢火蟲體發光反應相同，在螢光素（luciferin）與螢光素酶（luciferase）存在下，使ATP與螢光素及螢光素酶作用產生螢光。其反應方程式如下所示： 由上述原理設計之ATP冷光儀，因其可快速得到檢測結果，故已廣泛使用於職場環境衛生與清潔品質管控。本專題利用冷光試劑筆塗抹從衝擊式空氣採樣器採集至培養皿之樣本，使其產生上述之化學反應，再插入ATP冷光儀中測量所釋放之冷光 ,以此來定量ATP的數量。ATP冷光儀測量一個樣本所放出之冷光是以RLU來表示，所測得之RLU值與ATP數量是成正比的，同時也直接地與樣本的生物污染物質成正比。 設備及材料 1.ATP冷光儀及冷光試劑筆:MERCK、HY-LiTE 2；130101.0021 HY-Lite Refill Pack（圖1） 2.無菌操作台:川富 NAA-130 3.電子天平: METTLER TOLEDO EL204/IC 4.高溫蒸氣滅菌鍋:TOMIN 5.雙頭可攜型衝擊式採樣器: 型號DUO SAS 360 (圖2) 6.培養箱:HSIN CHIEN XIANG A830960830 7.培養皿: 55mm無菌塑膠培養皿 8.培養基:胰蛋白大豆瓊脂培養基（Tryptic Soy Agar），培養基添加真菌抑制劑 環己亞胺（Cycloheximide,100μg / mL）。 9.75 % 酒精:消毒擦拭用。 10.純水:Millipore （圖1） （圖2） 實驗方法 1.採樣前調配好胰蛋白大豆瓊脂培養基置於55mm無菌塑膠培養皿中，用石蠟膜封存並將其放在冰桶內。 2.到達採樣地點後，將兩個含培養基之培養皿放置於雙頭可攜型衝擊式採樣器內，以衝擊方式同時將細菌收集到兩個培養基上，設定好採樣器需要抽取的空氣體積和延遲時間，就可按下開始鍵進行採樣(抽取空氣500L、延遲1分鐘、採雙頭)。採樣時需配戴口罩、手套，手套要用75%酒精消毒，避免在採樣過程中污染樣品。（圖3） 3.每區之採樣均進行二重複。在進行下一次採樣前都要用酒精棉片擦拭過採樣器放置培養皿的地方。採樣地點有:某HACCP食品工廠、學生餐廳廚房A、學生餐廳廚房B及某市場雞肉攤。採樣原則:以採樣區域的中心點為採樣點，若有空調設備正下方則要避開。 4.採樣後，一採集頭內之培養皿置於 30 ± 1 ℃ 培養箱內培養 48 ± 2 小時，計算細菌之菌落形成單位(Colony-forming unit,CFU)。 CFU計算方法 : X = Pr×1000/V， X為CFU/m3 ，Pr為落菌數，V為採樣體積(L)（此計算公式參考雙頭可攜型衝擊式採樣器DUO SAS 360說明書）。另一採集頭內之培養皿則以冷光筆塗抹後，置於ATP冷光儀中測RLU 。（圖4、5） （圖3） （圖4） （圖5） 結果與討論 在上述之採樣地點共採樣46次，將二重覆採樣所測得之CFU與RLU值平均後，獲得的23組結果列於表1。使用Excel繪出表1之CFU值與RLU值之散佈圖（圖6），另分析兩者之相關係數為0.014255。故由所得結果可知CFU與RLU值之相關性很低，並無原先期待之正比例相關性，且無法求得迴歸方程式來配適兩者數據間的線性關係。 ATP冷光儀在操作過程中，測出之RLU值與培養所得之CFU值並不完全呈現正比，探究其原因，這些異常數據應與不同操作者在使用冷光儀時，冷光筆的搖晃力道與時間有所差異所造成，所以使用人員的熟悉度及技巧須再改進。而本專題所採樣之地點空氣菌落數過少，所測得之CFU及RLU值過低（圖7）。我國環保署室內空氣品質建議的第一類特別需求場所中指出，學校及教育場所、兒童遊樂場所、醫療場所、老人或殘障照護場所等區域，細菌的建議值範圍最高值為500CFU/m3；一般大眾聚集的公共場所及辦公大樓，包括營業商場、交易市場、展覽場所、辦公大樓、地下街、大眾運輸工具及車站等室內場所，細菌的建議值範圍最高值為1000CFU/m3。所以如要得到更客觀正確的標準曲線用於職場之空氣檢測，需至空氣菌落較多的環境進行更多的採樣分析，以提供高濃度菌落數及RLU值之數據群用於兩者相關性之分析。 最後，根據目前測得之現有數據，CFU與RLU值相關性低，無法獲得正確的線性方程式來評估職場空氣之細菌菌落數。故更多高污染職場的採樣會持續進行，以補數據之不足。