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DCM1/ 2009-2010/ Hématologie fondamentale

DCM1/ 2009-2010/ Hématologie fondamentale. Mécanismes de l’Oncogénèse en hématologie (2ème partie). Pascale CORNILLET-LEFEBVRE Laboratoire d’Hématologie. Homéostasie <=> Régulation de la survie, la prolifération, la différenciation, la mort, des interactions cellulaires des CSH.

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DCM1/ 2009-2010/ Hématologie fondamentale

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  1. DCM1/ 2009-2010/ Hématologie fondamentale Mécanismes de l’Oncogénèse en hématologie (2ème partie) Pascale CORNILLET-LEFEBVRE Laboratoire d’Hématologie

  2. Homéostasie <=> Régulation de la survie, la prolifération, la différenciation, la mort, des interactions cellulaires des CSH Cellules du Stroma médullaire Adhésion Régulation Cellules Prolifération Différenciation Apoptose Facteurs solubles derégulation

  3. Caractéristiques d’une cellule tumorale Cellules du Stroma médullaire adhésion --- Cellules Transplantée souris Nude => tumeur Prolifération Différenciation Apoptose + + - - - - - - Facteurs solubles de régulation (insensible)

  4. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (1) ACQUISES : par opposition aux anomalies constitutionnelles,héritées => uniquement retrouvées dans les cellules tumorales SPONTANEES : erreur de la DNA Polymerase => hémopathies « de novo » FAVORISEES : par de facteurs génétiques (voir diapo suivante) par des facteurs extrinsèques : chimiothérapie/radiothérapie/ pesticides/benzène/radiations ionisantes => hémopathies secondaires

  5. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (1 bis) CONTRÔLEES par des systèmes de sauvegarde : Systèmes intrinsèques : Systèmes préventifs ex fonction d’édition DNA Polymerase Systèmes palliatifs ex code génétique dégénéré Systèmes curatifs de réparation reconnaissance / réparation Systèmes extrinsèques : le système immunitaire cellules et leur capacité de produire des cytokines Immunosuppression (thérapeutique ou virale)

  6. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (2) MULTIPLES (cancer = processus multi-étapes) 1 événement génique nécessaire mais non suffisant Ex du rôle nécessaire mais non suffisant du remaniement bcl2-JH de la t(14;18) à l’origine d’un lymphome (folliculaire) • modèle animal de souris transgénique • Hyperplasie rate et gg (polyclonale) • Lymphome monoclonal (seulement après un délai de plusieurs mois et • avec remaniement de cmyc retrouvé dans 7/10) Présence du remaniement bcl2-JH chez les témoins «sains » identifié par PCR hypersensible Le remaniement de bcl2 en favorisant la survie des cellules favorise la survenue d’événement mutationnel surajouté.

  7. Leucémogénèse internet CHU de Rennes

  8. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (3) NON ALEATOIRES (récurrente) : Une anomalie primaireest à l’origine d’un type spécifique d’ hémopathie Elle est associée à l’initiation du processus tumoral (preuve fournie par des modèles de souris immunosupprimées transfectées par des virus contenant le remaniement étudié) Certaines anomalies secondairessont souvent associées à une anomalie primaire de tel ou tel type. Elles sont associées à l’évolution, la progression d’une hémopathie.

  9. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (3 bis) Cmyc Autres ? Délétion /mutation p53 Mutations bcl2 Activaton cmyc Réarrangement bcl3 Lymphome diffus à grandes cellules agressif Bcl2-JH =t(14;18) Lymphome folliculaire Cellule Normale Hyperplasie folliculaire Dup Phi Trisomie 8 Trisomie 19 i(17)q -7 -Y +17 +21 Anomalie 3 Anomalie spécifique Ex : t(15;17) Leucémie Aiguë LeucémieMyéloïde Chronique Bcr-Abl = t(9;22)

  10. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (4) Cellule atteinte : une Cellule Souche Hématopoïètique (CSH) ou un Progéniteur Hématopoïétique

  11. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (4bis) CLONALES = se produisant dans une cellule puis se propageant à l’ensemble des cellules filles qui en sont issues par division cellulaire (clone cellulaire de cellules identiques) Comment a-t’on pu identifier l’atteinte clonale de la CST dans la LMC ?

  12. LMC : atteinte clonale de la CST = argument cytogénétique t(9;22) Présence de l’anomalie de l’ADN caractérisant cette hémopathie [t(9;22)] dans toutes les lignées même lymphoïde B

  13. LMC : atteinte de la CST = argument clinique Évolution en LAL Évolution en LAM

  14. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (5) CIBLES des anomalies : les PROTO ONCOGENES anomalie doit porter sur une gène dont le rôle « physiologique » dans le maintien de l’homéostasie de la cellule est primordial. CONSEQUENCE de l’anomalie : PROTO ONCOGENE  ONCOGENE dérèglement du gène en question qui va être à l’origine de l’initiation et/ou du développement d’un processus tumoral

  15. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (6) NATURE des « ONCOGENES » : Gènes impliqués dans la transmission du signal mitotique : ex : tyrosine kinase (Abl) ex : facteur de transcription (cmyc) Gènes impliqués dans la différenciation ex : facteurs de transcription (Rara) Gènes impliqués dans le cycle cellulaire : ex : cycline (bcl1) Gènes impliqués dans l’apoptose : ex : bcl2 Gènes de régulation de prolifération, ou de différenciation ou d’apoptose = ANTI-ONCOGENE : ex :p53

  16. ONCOGENESE : caractéristiques des anomalies de l’ADN (7) NATURE de l’anomalie Translocation +++ Inversion Délétion => Points de cassure et « remaniement » Mutation Amplification Autres FLT3 : 20% Ras : 15% Ckit : 30% LAM CBF t(7;17) del(17)(p) Exemples donnés pour les LAM

  17. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : Généralités Hyperexpression : Juxtaposition de deux gènes => transcrit puis protéine de fusion bcr-abl de la t(9;22) Pml-Rara de la t(15;17) Mutation Ex : Jak2 V617F Ex : FLT3-ITD Amplification Ex: cmyc Juxtaposition d’un gène à un élément régulateur => dérégulation transcriptionnelle (gène des Ig et RTAg) bcl2-JH de la t(14;18) myc-JH de la t(8;14) Anomalie qualitative

  18. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : Conséquences Cellules Prolifération Différenciation Apoptose Bcr-abl t(9;22) LMC jak2 V617F PV + + - - - - - - PML-RARA t(15;17) LAM3 Bcl2-JH t(14;18) L Folliculaire

  19. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex bcr-abl • LMC : • Anomalie de la CS • Syndrome myéloprolifératif (SMP) • Prédominant sur la lignée granuleuse • Evolution en 3 phases cliniques : • 1- phase chronique (4 ans) • hyperleucocytose qui augmente progressivement • 2- phase d’accélération : • accélération de l’ hyperleucocytose • majoration de la blastose • 3- phase aiguë • transformation en LA • De bon pronostic car TTT ciblé très efficace • Association constante avec une anomalie chromosomique : • la t(9;22)

  20. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex bcr-abl Abl = activité thyrosine kinase (TK)en SH1 SH3 site de fixation de la protéine qui inhibe l’activité TK de Abl Bcr = rôle inconnu Bcr/Abl = transcrit de fusion à l’origine d’une protéine chimère Juxtaposition de bcr au domaine SH3 d’Abl => inhibition de la trans-inhibition physiologique d’Abl • exacerbation de l’activité TK d’Abl (constitutive) • Activation des voies de signalisation de la CST • prolifération excessive

  21. ONCOGENESE : Conséquences d’une anomalie : ex bcr-abl • Mais également : • Défaut d’adhésion des progéniteurs Phi+ au stroma médullaire (MEC) • Résistance aux stimuli de l’apoptose • Instabilité génétique => acutisation LAL/LAM • hypothèse : • expression de protéines réparatrices diminuée par bcr/abl => mutation/délétion (p53)

  22. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex Jak2 LMC 100% Bcr-Abl + PV 95-98% Jak2V617F TE 50% Jak2 V617F MFI 50% Jak2 V617F SMP non Phi+ :

  23. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex Jak2 • Mutation V617F : • Exon 12 de Jak2 • Domaine pseudokinase JH2 • Valine à la place d’une phénylalanine sur le codon 617 • Conduit à la perte du rôle autoinhibiteur de ce domaine sur le domaine catalytique kinase JH1 • =>Une activation constitituve de jak2 • => Insensibilité au FC (ex Epo) • Exacerbation de la myélopoïèse via altération mécanismes de survie/différenciation/prolifération • Thérapeutique ciblée en cours d’évaluation EPO-R EPO TPO-R TPO = MPL GSCF-R GSCF

  24. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : ex Jak2 Mutation V617F : La question comment une même mutation peut-elle être à l’origine de phénotypes différents (polyglobulie, thrombocytémie, myélofribrose idiopathique) n’a pas été encore résolue EPO-R EPO TPO-R TPO = MPL GSCF-R GSCF

  25. ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex PML-RARA • LAM3 : • Leucémie Aiguë myéloïde • Blocage au niveau du stade promyélocyte • Développement rapide (1 mois) • De bon pronostique si traité à temps : traitement ciblé et efficace par l’acide tout trans rétinoïque (ATRA) et l’arsenic • Association constante avec une anomalie chromosomique : • la t(15;17) ou variante

  26. 46,XY,t(15;17)(q22;q21)

  27. 46,XY,t(15;17)(q22;q21)

  28. ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex PML-RARA • PML =gène supresseur de tumeur (inhibition de la multiplication cellulaire) fonction est inconnue • RARa = récepteur de l’acide rétinoïque (ATRA) facteur de transcription recrute des histone acétyl transferase en présence des concentration physiologique d’ATRA (10-8 M) rôle majeur dans la différenciation myéloïde • PML-RARA = protéine chimère Exacerbation de la liaison de RAR avec un complexe protéique corépresseur de la transcription (N-CoR/Sin3/HDAC1) + inefficacité de l’acide rétinoïque à dose physiologique => répression de la transcription médiée physiologiquement via RARa Activation de la transcription HAT RARA Inhibition de la transcription par compaction de la chromatine Sin3 NCor HDAC PML RARA => Blocage de différenciation myéloïde

  29. ONCOGENESE: mécanismes d’activation des oncogènes : ex bcl2-JH • Lymphome folliculaire : • Forme un groupe homogène du point de vue clinique,morphologique • et immunologique • Dérive des cellules B des centres germinatifs normaux • Association dans 70% avec une anomalie chromosomique : • la t(14;18)

  30. ONCOGENESE : mécanismes d’activation des oncogènes : bcl2-JH Réarrangement bcl2-JH (Lymphome folliculaire) • Bcl2 : nature : protéine mambranaire (ancrée aux mambranes/mitochondrie) Rôle physiologique : = inhibitrice de l’apoptose via divers processus : anti-oxydatif/ dans le flux calcique • JH = partie de jonction de la partie variable du gène de la chaine lourde des Immunoglobulines mettant à proximité le promoteur du gène des IgH • Bcl2-JH => protéine bcl2 qualitativement normale => exacerbation de l’expression de bcl2 via la proximité du promoteur d’IgH => exacerbation de l’activité antiapoptotique de bcl2 => Inhibition de l’apoptose

  31. ONCOGENESE : Les étapes de la génétique INVERSE : gène-> protéine-> cible thérapeutique Identification sur le caryotype d’un remaniement stéréotypé associé à une hémopathie (banque de données internationales) Techniques de biologie moléculaire (banque génomique ou de cDNA ou FISH (cartographie physique) pour identifier le remaniement. Analyse des gènes/protéines impliqués non remaniés (fonction physiologique) Analyse du mécanisme d’activation par le remaniement Détermination des cibles des gènes /protéines Analyse de la conséquence du remaniement sur l’homéostasie cellulaire Recherche d’un médicament ciblé sur l’anomalie moléculaire

  32. ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (2) ex du transcrit bcr-abl antityrosine kinase : Imatinib/nilotinib spécifique de Abl, PDGF b et a, cKit agit en entrant en compétition avec l’ATP au niveau du site spécifique de liaison à l’ATP présent sur le domaine TK Pour le LMC : a permis d’atteindre une survie à 90% à 5 ans (première ligne)

  33. Site d’action

  34. ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (3) Ex transcrit PML-RARA (LAM3) : En présence de PML-RARA, l’ATRA à la concentration thérapeutique (10-6 Mol) • libère les co-répresseurs et lève la répression de la transcription via RARA • Augmente la transcription de RARA Activation de la transcription HAT ATRA RARA Inhibition de la transcription par compaction de la chromatine HAT PML RARA => Blocage de différenciation myéloïde

  35. ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (4) Ex anomalies des voies de signalisation activation mTor (Rapamycine) (LAM) activation NFkb (Velcade) (Myélome)

  36. voies de signalisation PTEN mTOR

  37. ONCOGENESE : de la découverte d’ONCOGENES à une cible thérapeutique (4) Ex modifications épigénétiques de l’ADN inhibition des histone desacétylase HDAC (MDS) agent hypométhylant (azacytidine/décitabine) (MDS)

  38. ONCOGENESE : exploration des anomalies de l’ADN MODES d’ EXPLORATION : Translocation +++ Inversion Mutation Délétion Amplification Autres …. Anomalie visualisable à l’échelle du chromosome => Explorée par le caryotype, la FISH et/ou les techniques de biologie moléculaire Anomalie visualisable à l’échelle du gène => exploration par les techniques de biologie moléculaire

  39. Exploration des hémopathies : Caryotype standard Bande G Bande R der(22)t(9;22) der(22)t(9;22) der(9)t(9;22) der(9)t(9;22)

  40. Exploration des hémopathies : FISH t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL 9q34 22q11

  41. Exploration des hémopathies : biologie moléculaire t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL RT-PCR multiplex en point final Protocole BIOMED-1 + Gène de contrôle 1 2 3 4 5 6 7 8 M b3a2b2a2

  42. Exploration des hémopathies : biologie moléculaire t(9;22)(q34;q11)/BCR-ABL RT-PCR quantitative b2/b3a2 Protocole standardisé Calibrateur Normalisation Bcr-Abl/Abl X100 XFC

  43. Exploration des hémopathies : biologie moléculaire Analyse des mutations Séquençage PCR RFLP PCR et analyse de fragment

  44. ONCOGENESE : Association anomalie/ diagnostic/pronostic : Anomalie moléculaire/chromosomique primaire /secondaire : ASSOCIATION ANOMALIE DIAGNOSTIC (histologique ou cytologique du type d’hémopathie) ASSOCIATION ANOMALIE PRONOSTIC (survie, sensibilité aux TTT,risque de transformation….) => THERAPEUTIQUE adaptée à la pathologie et adaptée aux risques

  45. LAM : Facteurs pronostiques Facteurs cytogénétiques Facteurs cliniques et biologiques Âge Hyperleucocytose Antécédents de myélodysplasie/myéloprolifératif Facteurs de comorbidités associés Absence de réponse après première cure Expression de gène de résistance aux chimiothérapies 15% 65% Facteurs moléculaires 20%

  46. Allo et FLT3-ITDneg/NPMc Döhner et al, Blood 2005

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