Download
1 / 103
1.03k likes | 1.28k Vues
Vybrané pojmy pro molekulární klonování. Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., Ústav imunologie, LF Univerzita Palackého v Olomouci. Základní pojmy.
E N D
Vybrané pojmy pro molekulární klonování Doc. MUDr. Mgr. Milan Raška, Ph.D., Ústav imunologie, LF Univerzita Palackého v Olomouci
Základní pojmy Operon - skupina genů nebo segment DNA, které fungují jako jedna transkripční jednotka. Zahrnuje operátor, promotor a jeden nebo více strukturních genů, které jsou transkribovány do polycistronické mRNA. Gen - základní, fyzická a funkční jednotka dědičnosti. Strukturní gen - úsek DNA zapojený do produkce polypeptidového řetězce. Určuje strukturu proteinu a RNA molekuly ale zahrnuje i oblasti zapojené do regulace jejich exprese. Ne-regulační gen. Operátor - oblast DNA, na kterou se váže specifický protein (represor), bránící iniciaci transkripce z přilehlého promotoru. Promotor - oblast DNA, na kterou se váže RNA polymeráza a transkripční faktory zahajující transkripci mRNA.
Základní pojmy Cis-trans komplementační test - párovací test sloužící k určení zda dvě různé recesivní mutace na opačných chromosomech diploidního organismu (pozice in trans) se vzájemně kompenzují (komplementují). Pokud ano, postihují různé geny, pokud ne, postihují stejný gen. Tento test se označuje i jako test alelismu Cistron – (Benzer) nejmenší genetická jednotka nevykazující genetickou komplementaci dvou trans mutací ve výše zmíněném cis-trans testu, ale vykazující genetickou komplementaci, jestliže tytéž mutace jsou na jednom chromosomu (v poloze in cis). Cistron je tedy slučitelný s pojmem kódující částí jednoho genu. Cis regulace - odpovídající cis poloze v cis-trans testu. Polycystronická mRNA - mRNA kódující více než jeden protein. Vnitřní místo nasedání ribozomů – místo mezi dvěma úseky mRNA kde může dojít k sestavení ribozomu a iniciaci translace mimo 5’nepřekládanou oblast
Základní pojmy Čtecí rámec - transferové RNA (tRNA) nasedají na templátovou mRNA v přesně určených pozicích podle principu komplementarity bází a přinášejí aminokyseliny k tvorbě polypeptidového řetězce. Komplementarita bází - báze se spojují vždy A-T nebo C-G. Toto pravidlo je nutné dodržet při navrhování překryvných míst a kohezivních konců DNA během klonování. GMO - geneticky modifikovaný organismus. Vnesením cizorodé DNA jinou než přirozenou cestou (jako je infekce bakteriofágem či virem, konjugací přirozených plasmidů a td.) Manipulace je definována zákony a vyhláškami České republiky (zákon 178/2001; 185/2001; 78/2004; 346/2005; vyhláška 209/2004; 195/2005; 86/2006) a nařízeními Evropského parlamentu a Rady (ES) (1830/2003; 1946/2003). Roční hlášení
Základní pojmy Nonsense suppression - potlačení efektu STOP kodonů v důsledku přítomnosti abnormálních tRNA - vážou se na STOP triplet a přinášejí aminokyselinu - umožňují další průběh translace. - geny jsou uvedeny v genotypu bakterie (SupD, SupE) - většina supresorových tRNA nasedá na STOP Amber (UAG), Orche (UAA).
Získání templátu kódujícího požadovaný rekombinantní protein
Identifikace kódující NK Protin o známé sekvenci mRNA, cDNA, DNA (sekvenčně specifická amplifikace cDNA, PCR) Protein u nějž je známá sekvence u jiného druhu (identifikace hybridizací, sekvenčně specifická amplifikace cDNA , PCR) Protein u nějž je známá sekvence pouze určitého fragmentu (identifikace mRNA nebo cDNA hybridizací, sekvenování, PCR) Neznámý protein (izolace funkční frakce (fenotyp) buněčného lyzátu a analýza sekvence proteinu, návrh prób umožňující identifikaci a izolaci genu z cDNA knihovny hybridizací, PCR, srovnání s dostupnou databází genů ....
Prokaryotní / eukaryotní geny • Prokaryontní geny jsou bez intronu • Pro klonování není nutné pracovat s mRNA • Pokud je známa sekvence požadovaného genu možná PCR amplifikace genomické DNA • Eukaryontní geny jsou mnohem složitější • Genomická DNA obsahuje introny a dlouhé 5’ a 3’ nepřekládané oblasti • Při izolaci genu se nejčastěji pracuje s cDNA • Připravena reverzní transkripcí mRNA izolované z buněk • Odpadá komplikované hledání a eliminace intronů • NetGene2 server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/).
E. coli v molekulárním klonování
Základní charakteristika E. coli • Gram negativní tyčka • Cirkulární chromozomem 3.106 párů bází • Roste na minimálním médiu obsahujícím • zdroj uhlíku (glukóza) • soli jako zdroj dusíku, fosforu a stopových kovů • Na médiích obohacených aminokyselinami, prekurzory nukleotidů, vitamíny atd. roste mnohem rychleji • Po naočkování inokula do obohacených médií • úvodní lag fáze • exponenciální fáze log (zdvojovací čas 20 - 30 minut) • V log fázi setrvává dokud • nespotřebuje veškeré živiny • nespotřebuje kyslík • zplodiny metabolismu (kyseliny) nepřesáhnou hranici inhibice růstu • nepatogenní linie E. coli K-12 je prekurzorem pro většinu laboratorních kmenů • původně izolovaná v roce 1922 ze stolice pacienta uzdravujícího se z difterie v Palo Alto v Kalifornii.
Základní charakteristika E. coli • Jsou popsány plasmidy dobře se replikující v E. coli • Plasmidy jsou schopny nést DNA inzerty od stovek po statisíce párů bází (bacmidy) • V E. coli probíhá α komplementace • Je známa řada antibiotik použitelných pro selekci E. coli (Ampicillin, Kanamycin, Chloramfenikol, Tetracyklin, Neomycin Zeocine) • Dobře popsány metody transformace E. coli • chemická CaCl2, RbCl, CCMB80 (KOAc+CaCl2+MnCl2+MgCl2) • elektroporace • Vyvinuty kity na izolaci plasmidové DNA z E. coli
Kultivace E. coli • Minimální média • A médium: obsahuje v 1 litru média 1 g (NH4)2SO4; 4,5 g KH2PO4; 10,5 g K2HPO4; 0,5 g citrát sodný 2H2O; 1 mM MgSO4·7H2O; 0,2% glycerol (nebo cukr). • Bohatá média • Luria nebo Lenox Broth (LB): obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 5 g kvasničného autolyzátu; 5 g NaCl; (1 mN NaOH). • H medium: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 8 g NaCl • Lambda broth: obsahuje v 1 litru média 10 g tryptonu; 2.5 g NaCl • Obohacení některými nutrienty můženapříklad usnadnit purifikci některých kontaminujících proteinů
α komplementace α komplementace - je fenomén, kdy exprese dvou genů, z nichž jeden kóduje N’ terminální úsek -galaktozidázy (ɑ fragment) a druhý kóduje C’ terminální úsek -galaktozidázy (ω fragment), vede k vytvoření funkčního enzymu sestavením dvou polypeptidových podjednotek po jejich nezávislé translaci
F faktor, F plasmid V praxi minimalizovaná verze geny záměrně vnesené do F plasmidu (nebo F episomu) ori místo pro zahájení replikace rep gen kódující replikázu par segregační geny kódující jednotlivé podjednotky topoizomerázy IV a ccd (ccd stands for coupled cell division) geny vnášeny geny rezistence na antibiotikum, pomocí nějž je plasmid udržován v následujících generacích a dále například gen kódující ω fragment -galaktozidázy umožňující komplementaci. XL-1 Blue F'[ ::Tn10 proAB+ lacIq Δ(lacZ)M15]. F' = bakterie, potomek kmene, v němž do chromozomu integrovaný F faktor uvolnil i s několika chromozomovými geny a dále je ve formě episomu. [Geny získané z chromozomální DNA] část transpozonu Tn10 - gen rezistence na tetracyklin proAB - γ-glutamyl fosfát reduktáza a kináza - metabolismus prolinu represor laktózového operonu lacI, gen kódující ω fragment -galaktozidázy Δ(lacZ)M15.
Antibiotika běžně používaná pro selekci transformovaných E. coli
Selekce transformovaných E. coli • Ukázka optimální hustoty kolonií E. coli pro sekci
Satelitní kolonie ampicilin • Ukázka satelitních kolonií po vyočkování husté bakteriální suspenze na LB agar – typický obraz pro selekci Ampicilinem • Šipky ukazují centrální kolonie transformovaných E. coli. Do okolí je sekretována β-laktamáza. • Jakmile dojde v okolí centrální kolonie k degradaci Ampicilinu, začnou se objevovat satelitní kolonie.
Sterilizace laboratorního materiálu • horkovzdušná sterilizace 160°C, 2 hod • autoklávování 120 – 136°C, 20 - 30 min • chemická (70% alkohol, ostatní) a UV sterilizace povrchů • Sterilizace médií – filtrace 0,22 nebo 0,1 mm • Manipulace s kultivačními nádobami • uspořádání pracovní plochy • postup otevírání a zavírání kultivačních nádob • způsob pipetování • po doteku okolních povrchů předpokládat přenos kontaminace
Optimalizace kodonů Exprese genů eukaryot nebo prokaryot v euakryotním nebo prokaryotním expresním systému A B
Optimalizace kodonů • Exprese genů eukaryot nebo prokaryot v euakryotním nebo prokaryotním expresním systému • Exprese cizorodých (virových) proteinů nečekaně nízká • Transgenem kódovaná mRNA využívá tRNA s jinou frekvencí než hostitelská buňka • Důsledek - buňka nemá dostatek některých tRNA pro translaci proteinu • možnost optimalizace kodonů (codon optimization) • analýza pomoví www aplikací (in silico analýza) • k aa sekvenci se přiřadí nová cDNA , aby poměrné zastoupení tRNA odpovídalo hostitelské buňce • cDNA lze připravit • cílenou mutagenzou • připravit sunteticky buď celou nebo část • Výtěžek rekombinantního proteinu se obvykle zvyšuje v rozsahu jednoho řádu • Kodonová optimalizace může zefektivnit například i DNA vakcinaci
Proč RNA • reprezentuje obraz aktuální proteinové produkce buněk, tkáně • výhodné neboť odpadá nutnost eliminace intronů u eukaryotních genů • přepis do cDNA možný i když neznáme kompletní sekvenci • vhodné pro přípravu cDNA knihovny
Příprava na izolaci RNA • RNase free podmínky - RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami • roztoky (DEPC, certifikované chemikálie od dodavatelů) • laboratorní materiál • plast (chloroform - 2 hod; 0,1 – 0,02 % DEPC ddH2O – 2 hod) • (0.1 M NaOH, 1 mM EDTA - 2 hod; DEPC ddH2O – 2 hod) • (certifikovaný plast, nově otevřené balení standardního plastu) • sklo (mytí jako pro tkáně, žíhání horkovzdušný sterilizátor 180°C, 8 h • laboratorní přístroje (čistota, RNAzap, chloroform) • laboratorní pracovník (čistota, organizace práce, rukavice)
Guanidinová metoda izolace totRNA RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami • Resuspendovat bb. v denaturačním roztoku (10 ml/1g buněk) • guanidin thiocyanate 4M (efektivní denaturace proteinů, RNA solubilní) • citrát sodný 25 mMpH7 • N-lauroylsarcosine 0.5 % • 2- ME 0.1 M těsně před použitím (1.8 ml) • přidat CH3COONa na finální 100 mM • přidat vodou saturovaný fenol (objem ekvivalentní objemu denat. roztoku) • přidat CH-IAA (0,2 objemu fenolu) homogenizovat a inkubovat 15 min 0°C • Kyselý F-Ch-IAA = DNA a proteiny v organické fázi • centrifugace a přenos vodní fáze do nové zkumavky a další reextrakce • precipitace ekvivalentním objemem isopropanolu • rozpuštění pelety v DEPC-ddH2O
Guanidinová metoda izolace totRNA RNázy jsou vysoce stabilní enzymy, nevyžadují kofaktor – nutno je denaturovat v prvním kroku manipulace s buňkami • Směs všech komponent (kromě chloroform-IAA) v jednom roztoku je základem • mnoha komerčně dostupných kitů • Isogen (Nippon Gene) • RNA-Stat 60 (Tel-Test) • RNAzol B (Cinna Scientific) • Tri-Pure Isolation Reagent (Boehringer Mannheim) • TRI Reagent (Molecular Research Center) • TRIzol Reagent (Life Technologies)
Izolace RNA pomocí anexové kolony RNeasy Aktivované silikagelové kolony umožňují purifikaci RNA pomocí guanidinových pufrů s proměnnou koncentrací solí (Qiagen)
