Transzdukció

2. Transzdukció Bakteriofágok közvetítte genetikai információ csere Két fő bakteriofág típus Virulens fágok/lítikus fágok – fertőzik a sejtet, gyorsan szaporodnak, lizálják a sejtet Mérsékelt fágok/temperált fágok – fertőzik a sejtet, be tudnak épülni a genomba és profágként alvó állapotban – néha kivágódnak, szaporodnak és lizálják a sejtet

3. Bakteriofágok morfológiája változatos RNS-t vagy DNS-t tartalmaznak fehérje burokban Szinte minden baktériumnak van fágja.

4. A gazdabaktériumuk sejtjének felületén lévő specifikus receptorhoz kapcsolódnak Nukleinsavukat a gazda sejtbe injektálják Smithsonian (Oct 2000) T4 bakteriofágokegyE. coli sejt felületén

5. Mérsékelt fág A gazda genomba épül be – félalvó állapot (a baktérium így lizogén bakt.) (pl. λbakteriofág)

6. Fágkonverzió Az alvó profág – az integrálódott bakteriofág – a mikróba fenotípusát megváltoztató géneket hordoz - pl. a patogének és a toxin termelés toxin profág inzerciós hely (att site) Corynebacterium diptheriaea A fág génekről termelődik a toxin. Ez betegíti meg az embert. C.diptheriaea A fág nélkül a törzs nem termel toxint. Nem okoz diftériát.

7. A fágfertőzés lizogén útvonala

8. Transzdukció (specializált) • specializált transzdukció • LFT, kis frekvenciájú transzdukáló lizátum • HFT, nagy frekvenciájú transzdukáló lizátum • A specializált transzdukció  fág

9. A specializált transzdukció egyszerű mechanizmusa

10. Specializált transzdukció (Hibás kivágódás!!!)

11. Specializált transzdukció •  fágnál (gal, bio markerek) • A profág pontatlan kivágódásával • A profág beépülése melletti gének is bejutnak a fágfejbe • Kis gyakoriságú jelenség • A hiba folytán kis valószínűséggel keletkeznek olyan fágok is, melyek hordoznak baktérium gént • LFT, kis gyakoriságú transzdukáló lizátum • Mivel a lambda fág fejmérete nagyobb, mint ami a fág DNS-hez szükséges méret (75%-109%) transzdukció esetén fág funkció sérülhet (defektív fág, minél nagyobb az átvitt bakterium DNS darab annál defektívebb a fág)

13. Ha a fág defektív, helper fág kellhet a sikeres lizogénia kialakításához • A termelésnél nincs probléma, mert a jelenlévő intakt fág funkciók biztosítják a normális működést (többszörös genom ekvivalens) • Transzdukáló fággal lizogenizált baktérium is előfordul • Ugyanúgy indukálható, mint más lizogén • Ha defektív, akkor nem keletkezik fágrészecske • Ha a defektív funkciót teljes helper fággal kiegészítjük, indukció során az összes fágrészecske 50%-a transzdukáló HFT High frequency

14. A virulens fágok egylépéses szaporodási görbéje - A latencia periódus alatt a fággenom replikálódik és a gazda genom teljesen leépül

15. A fágfertőzés látható hatása a gazda DNS-re T4 fág DNS Fertőzés előtt Fertőzés után

16. A fágfertőzés lítikus ciklusa

17. Általános transzdukció (hibás pakolás!!!)

18. Transzdukció • DNS átvitel baktérium sejtek között bakteriofág segítségével • Általános transzdukció • A transzdukáló fágrészecske csak bakteriális DNS-t hordoz • Pszeudovirion, mert a saját szaporodásához szükséges tulajdonságokat nem hordozza

19. A fágok egy részénél fejméretű a pakolás, ami lehet hibás is – a pakoló mechanizmusnak nincs specifikus felismerő helye Így pakol a Salmonella typhimuriumP22 fágja és B. subtilis PBS1fágja

20. Mi történik a recipiens sejteben?

21. A baktériumok közötti géncsere hatékony módja a generalizált, vagy általánostranszdukció Hibás pakolás!!! Közeli genetikai bélyegek térképezése!

22. Példa – transzdukió a Salmonella typhimuriumP22 fágjával P22 HT – hatékony általános transzdukáló - hanyag fág – a fágrészecskék 50%-ában gazda DNS, azaz transzdukáló részecske ( transducing particles = TP) Minden fejben (TP) 44 kb-nyiDNS – aSalmonella genom kb. 4400 kb nagyságú Ezért, ha a pakolás teljesen véletlenszerű, akkor 100 különböző fágrészecske a teljes genomot reprezentálhatja. 1011 P22 HT fág/ml szaporítható – tehát ebből 5 x 1010–ben gazda DNS van  1 ml-benkb. 5 x 108 Salmonella genomnyi (0.5)(1011fág/ml)/(100 TP [1 genom]) = 108genom kópia/ml alizátumban

23. P1 fág • 100 kbp • Pac helytől fejméretű pakolás • DNS - Terminális redundancia, cirkuláris permutáció • Általános transzdukció

24. MÁS FÁGOK • T4 (virulens) mutánsa • Lambda • Mu (transzpozon), DNS-e két végén gazda DNS

25. Transzformáció • Pneumococcus (Stapylococcus) Bacillus transzformáció • Kompetencia • DNS felvétel/bejutás • Donor DNS megtartása a recipiensben • Más transzformációs rendszerek • Haemophilus influenzae • Escherichia coli • Elektroporáció • Protoplaszt transzformáció • Transzfekció – fág DNS-sel • E. coli • B. subtilis • Géntérképezés transzformációval

26. Transzformáció • Genetikai információátvitel (az első amit felfedeztek) • Donor sejt nagyméretű DNS-t bocsájt ki • A DNS a tápközegben diffundál (a recipiens felé) • A DNS transzportálódik sejtfalon, sejtmembránon keresztül a citoplazmába, ahol rekombináció történik • Ez a transzformáció genetikai információátvitel, nem a normál sejtek tumorrá történő transzformációja (eukarióták esetén)

27. Jelentősége? • Mivel a DNS könnyen degradálódik, azt gondolták nincs valós szerepe (csak a laboratóriumban) Ezzel szemben számos természetes genetikai transzformációs rendszer létezik: Achrobacter, AzotobacterBacillus, Butyvibrio, Campylobacter, Clostridium, Hemophilus, Micrococcus, Mycobacterium, Neiserria, Pseudomonas, • Streptococcus, Streptomyces, Synechoccus • Valamilyen jelentőségnek kell lennie • Kimutatták még: • Talajba jutattott plazmid és kromoszóma DNS fennmarad, mi több a Pseudomonas stutzeri és a Bacillus subtilis transzformálódik is • Egér > DNS etetés után kimutatható a DNS a vérben is, így lehet olyan sejt is , amelyik felveszi ( immunizálás )

28. Transzformáció felfedezése és utóhatásai • Pneumococcus • Sima, poliszacharid burokkal rendelkező telep • patogén • Durva telep, kapszid poliszacharid hiánya • Nem patogén • Klasszikus transzformációs kísérlet • Avery kimutatja a transzformáló elv a DNS • Senki nem akarja elhinni • Hershey és Chase DNS és fehérje radioaktív jelölés (külön) • Watson és Crick, a DNS szerkezete • Pneuomococcus = Streptococcuspneumoniae • Bacillus subtilis 168

29. Transzformáció • A transzformáció az a folyamat, amikor a sejtek „tiszta” DNS-t vesznek fel és építenek be. • Két fő típus • Természetes transzformáció (a mikróbáknak csak kis csoportja) • - általában lineáris DNS • 2. Mesterségesen indukált (a legtöbb, de nem az összes mikroorganizmus képes így DNS felvételre) • - általában plazmid DNS • Az a sejt, amelyik képes a DNS felvételére az kompetens.

30. Mesterséges kompetencia A molekuláris biológia egyik legfontosabb, alapvető technikája, lehetőség, hogy idegen DNS-t vigyünk be a baktérium gazdába. Gyakran csak úgy érhető el, hogy mesterséges-kompetens sejteket készítünk. Az E. colifelvesz és replikál gyűrűs DNS-t. A mesterséges transzformáció két típusa: Kémiai kompetencia Elektroporáció/elektrotranszformáció, biolisztikus (génpuska) PROTOPLASZT PoliEtilénGlikol = PEG

31. Kémiai kompetencia Néhány baktériumba, köztük az E. coli-ba, a kétértékű kationok, kis hőmérsékleten segítik a plazmid DNS felvételét ( a lineáris DNS-t is felveszik, de a citoplazma DNáz-ai gyorsan feldarabolják, még mielőtt bármit is tudna tenni) Nem teljesen világos, hogy hogyan is van. Felvételi csatornák: poliP, PHB, és Ca

32. Nagy feszültség sokk Elektroporáció Nagy térerősség átmeneti lyukakat eredményez a sejtfalban Alkalmas körülmények között a DNS be/ki szivárog. A kinti nagy plazmid koncentráció gyors beáramlást eredményez. Elektroporációs küvetta Ide kerülnek a sejtek

33. A transzformáció hatékonysága? Transzformációs gyakoriság Sejtszámra(transzformánsok száma/μg DNS) 106-109/μg pBR322 kb. 1011 plazmid/μg pBR322 úgy is mérhető, hogy a sejtek hány %-a kapott plazmidot DNS-re a DNS molekulák hány %-a transzformált sejtet

34. Természetes kompetencia/transzformáció gram-pozitívokban Pl.: Streptococcus pneumoniae Bacillus subtilis -nem specifikus -korlátozott számú felvevőhely (30-75) -nick képződés -a komplementer szál degradálódik a felvétel közben -rekombináció a recipiensben

35. Természetes transzformáció gram-negatív Pl.: Haemophilus influenzae Neisseriae gonorrhoeae -szekvencia specifikus -4-8 hely/sejt -nincs sejthez kötött intermedier -dsDNSimport a periplazmába -komplementer degradálódik a citoplazmába történő transzport során -rekombináció a recipiensben

36. Gram-pozitív felvevő rendszer -jó gépezet a sejtekbe történő DNS szállításra a konjugációs rendszer fordítottja - néhány komponense a Tra funkciókhoz hasonlít

37. Gram-negatív felvevő gépezet -ez se rossz - keresztezni kell a periplazmát és a külső membránt

38. A folyamat energia ellátása? • Intracelluláris ATP hidrolízis • pH gradiens – PMF (proton motive force)? • komplementer degradáció • Funkciója • Tápanyag • DNS repair • Genetikaiidentitás/diverzitás

39. Transzformáció • Kompetencia kialakulása • DNS kötődés és bejutás • A DNS integrációja a recipiens sejtben

40. Kompetencia • Az alapelv nagyon hasonló (természetben előforduló) • Kompetencia = az a képesség, mellyel a DNS megkötésre kerül, ezáltal védett lesz a nukleázokkal szemben • A kompetencia időzítése különbözik • Szinte minden esetben (amit tanulmányoznak) fejlett szabályozás alatt áll a kompetencia

41. A kompetencia fiziológiája • Meghatározott fiziológiai állapot • Valamely fejlődési szakaszhoz, vagy tápanyag ellátottsághoz kapcsolódik (legtöbbször, tápanyag hiány kialakulása kapcsolja be) • B. subtilis esetében hőmérséklet csökkenés is kiválthatja (42°C>37°C) • A szabályozó rendszerben olyan represszorok vannak, melyek • egyrészt flagella és kemotaxis géneket • másrészt kompetencia géneket aktiválnak

42. Kivételek • Bakteriofág is indukálhat kompetenciát (Staphylococcus aureus) • Exponenciális növekedési szakaszban alakul ki a kompetencia (S. pneumoniae) • Antibiotikumok hatására, szubletális koncentráció • A tenyészetben lévő kompetens sejtek száma változó (15% Bacillus-Streptococcus, 100%) • A kompetencia kialakulása függ a sejtszámtól (sejtsűrüség faktorok, peptidek)

43. Kompetencia kialakulása rövid ideig tart (pár perc) • Stacioner fázisban • Bacillusoknál, ha a kétszereződési idő 150-390 perc • Mivel kemosztát kultúrában is van kompetencia, de nincs sporuláció, ezért a sporuláció nem szükségszerűen kapcsolódik a kompetenciához • Hasonlóan a korai sporulációs génekben mutáns baktérium kompetens

44. A B subtilis kompetens sejtek: • Kisebb sűrűségűek (gradiens centrifugálással elkülöníthetők a normál sejtektől) • Kisméretűek • Egy nem replikálódó genomja van • A kompetens sejtek membránja 4* több PHB-t (polihidroxi-butirát) tartalmaz, (egyébként raktározó szerepe van) • Segít egy transzmembrán csatornát kialakítani

45. S. penumoniae • Kompetens sejtek membránján kompetencia faktor • Ez a közegbe is kikerül • Ettől a nem kompetens sejtek kompetenssé válnak, úgy hogy a kompetencia faktor egy másik membrán fehérjéhez köt (comD terméke) • A kompetencia faktor kötésével legalább 10 fehérje kezd el szintetizálódni • A kompetencia faktor megmagyarázza, miért kell nagy sejtsűrűség, nagyobb a valószínűsége, hogy megtalálja a receptorát • A com lókusz mutációi megakadályozzák a kompetencia kialakulását

46. comA terméke hasonlít az ATP függő transzport fehérjékhez (melyek toxin fehérjéket szállítanak a sejt felszínére, coli hemolizin gén) • A kompetencia kialakulásával a sejtfal porózusabbá válik • Az autolitikus enzimaktivitás növekszik • Baktérium sejtek láncolata hosszabb lesz • A legtöbb változás a sejt egyenlítői síkjában következik be, ahol a növekedés történik, és ahol a DNS felvétel történik

47. DNS kötés • Kompetens és nem kompetens sejt is köt DNS-t • A nem kompetens sejtben lemosható a DNS, a kompetens sejtben nem mosható le egyszerűen • EDTA hatására a DNS megkötődik, de minden további feldolgozás megáll • Kb. 50 DNS kötő hely van a kompetens B. subtilis felszínén • A kötött DNS érzékeny a nukleázokra és a nyíróerőkre • Bármilyen eredetű DNS kötődhet • Minimum 500 bp hosszú fragmens kell a kötéshez • Egyszálú, glükozilált DNS, ds RNS, RNS-DNS hibrid nem kötődik

48. DNS bejutás • A következő lépés a DNS bejutása a sejtbe • A 3’ végtől kezdve • A bejutás előtt a kötőhely melletti endonukleázok megfelelő méretre hasítják a DNS-t • Véletlenszerű hasítás • Eredmény 15 kb-nál nem nagyobb DNS fragmensek (kisebb, mint amekkorát a transzdukáló fágok bejuttatnak) • Az endonukleázoknak magnéziumra vagy kalciumra van szükség (ezért érzékeny az EDTA-ra) • Ebben a fázisban, ha szétválasztjuk a DNS-t és a sejteket a kettős szálú DNS alkalmas a transzformációra

49. Következő lépés az eklipsz komplex kialakulása • A DNS kötődik egy kompetencia specifikus fehérjéhez • Ezáltal a DNS egyszálú lesz • Védett lesz a külső nukleáz hasítással szemben • Teljesen véletlenszerű, hogy melyik szál hasad le és az is, hogy milyen helynél kezdődik a hasítás • A lebomlott szál nukleotidjai a médiumba kerülnek