实验八多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术

实验八多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术

一．实验目的及背景 • 多聚酶链式反应(polymerase chain reaction)简称ＰＣＲ技术，是８０年代中期发展起来的一种体外扩增特异ＤＮＡ片段的技术。此法操作简便，可在短时间内在试管中获得数百万个特异的目的ＤＮＡ序列的拷贝，ＰＣＲ技术虽然问世仅数年时间，但它已迅速渗透到分子生物学的各个领域，引起了生物技术发展的一次革命，目前它在分子克隆，目的基础检测，遗传病的基因诊断，法医学，考古学等方面得到了广泛的应用。 • ＰＣＲ技术实际上是在模板ＤＮＡ，引物和４种脱氧核苷酸存在的条件下依赖于ＤＮＡ聚合酶的酶促合反应，ＰＣＲ技术的特异性取决于引物和模板ＤＮＡ结合的特异性。反应分三步：①变性（denaturation）；②退火（annealing）；③延伸（ex tension），反应过程见图。

模板ＤＮＡ在９４℃条件下变性形成单链； 在５５℃条件下根据目的基因两侧序列设计的引物分别与其同源序列结合；７０℃下在耐热性ＤＮＡ聚合酶Taq 酶催化下，在４种dNTP存在条件下延伸形成双链。完成一次循环。接着又以新合成的ＤＮＡ为模板进行同样反应，如次往复循环３０次，由于每次循环目标ＤＮＡ都以２n次幂扩增，３０次循环后目的DNA的量增加１０６－７倍。成功的ＰＣＲ反应要求反应有很好的特异性，和相当的扩增效率。要达此目的ＰＣＲ反应要注意以下问题：

１．ＤＮＡ模板：反应中ＤＮＡ量在５０ng～２００ng左右。且ＤＮＡ纯度较高， 以增加反应特异性。 • ２．dNTP:反应体系中达100μM～200μM。 • ３．Mg2+：Mg2+是Taq酶的辅基浓度在2.0mM左右，浓度太低Taq酶活力降低；太高反应特异性降低。 • ４．引物：根据目的基因两侧特定序列设计。引物约20碱基左右；Ｇ＋Ｃ含量在40 ％－70％之间；引物内部不能有回该序列；引物３’端不能互补。 • ５．Taq酶：它是从嗜热杆菌中提取的耐热性ＤＮＡ聚合酶，在９５℃时３０分钟还有５０％活力。

６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。６．变性温度：在９３～９５℃之间使模板充分变性。 • ７．复性温度：５５℃左右，此温度选择是根据模板和引物配对结合强弱而定，它是反应特异性的决定因素。 • ８．延伸温度：７０～７２℃左右，为Taq酶最适反应温度。

二．实验试剂及仪器 • １０×buffer: 500mM KCl • 100mM Tris-HCl (pH9.0) • 0.1% 明胶 • 1% TritonX-100 • MgCl2 2.5mM • ４×dNTP: 1mM • 引物：TGGCCGAGCTG 5.0uM • 模板： 20ng/μl • Taq酶： 5u/μl • PCR仪，凝胶成像系统，电泳系统

三. 实验方法 • １．向无菌的500μl Eppendorf管中依次加入以下溶液。 • 反应物体积 • 10×buffer 2.5μl • 4×dNTP(1mM) 2.5μl • MgCl2 (25mM) 2.5μl • 无菌水 10.5μl • Taq酶 (1U/ul) 1μl • 引物 2μl • 模板ＤＮＡ (20ng) 4μl • 总体积 25μl

2．反应体系混匀，离心 • 3．在ＰＣＲ仪上按以下方式循环 • ９4℃变性１分钟 • 36℃退火１分钟 • 72℃延伸２分钟 • 经过40个循环 • 4．７２℃延伸反应7分钟。 • 5．取20μl反应液加4μl Loading buffer在 • 6.１．５％琼脂糖凝胶上120伏，电泳2小时。 • 7. 在凝胶成像系统上观察记录实验结

四. 结果分析 • １．记录实验结果，并估测ＰＣＲ扩增产物分子量。 • 问题与讨论： • １．简述ＰＣＲ基本原理 • ２．进行一次成功的ＰＣＲ反应顺注意哪些问题。

实验八 多聚酶链式反应（ＰＣＲ）技术