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微生物实验常用技术

微生物实验常用技术. 何平 病原生物学教研室. 常用的体外微生物实验技术。 常用的体内微生物实验技术。. 常用的体外微生物实验技术. DNA recombination DNA 重组 SSH 抑制性 消减杂交 Microarray 基因芯片 新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用. DNA 重组. 同源重组 （ homologous recombination ） 非同源重组 （ no homologous recombination ）： 位点特异性重组 （ site-specific recombination ）

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微生物实验常用技术

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Presentation Transcript

  1. 微生物实验常用技术 何平 病原生物学教研室

  2. 常用的体外微生物实验技术。 • 常用的体内微生物实验技术。

  3. 常用的体外微生物实验技术 • DNA recombination DNA 重组 • SSH 抑制性消减杂交 • Microarray基因芯片 • 新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用

  4. DNA 重组 • 同源重组（homologous recombination） • 非同源重组（no homologous recombination）： 位点特异性重组（site-specific recombination） 转座重组（transposition recombination） 异常重组（illegitimate recombination）

  5. 同源重组的机制 • Holliday模式 • 单链发生切割产生缺刻 • 切割链与对方互补链配对 • 缺刻被封闭，两条DNA双链形成铰链分子。 • 形成异源双链区 • 重组中间体形成 • 在铰链处的另一条链上发生切割。 • 形成重组DNA分子

  6. Jian-ping Yuan, et al. World J Gastroenterol 2003;9(10):2251-2257

  7. SSH 抑制性消减杂交 • SSH（Suppression subtractive hybridization） • 什么是SSH，原理 • SSH的历史，发展与现状 • 微生物研究中的应用 • 优缺点

  8. 问题 • 不同菌株间毒力不同 • 病原体在体内，外表达的不同

  9. 解决方法 • 测序 • 基因芯片，蛋白芯片 • SSH

  10. 什么是SSH • SH, 1990,首次用于微生物研究： 野生株酵母与变异株酵母进行消减杂交

  11. SSH • 1996,Diatchenko在SH基础上进一步改善技术 • 1998年第一次用于研究细菌幽门螺杆菌 • 现可以买到Clontech PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit的试剂盒现可以买到Clontech PCR-Select Bacterial Genome Subtraction Kit的试剂盒

  12. adapter 1 5’-GTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAGCGGCCGCCCGGGCAGGT-3’ 3’-CCCGTCCA-5’ adapter 2 5’-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3’ 3’-GCCTCCCGCCA-5’

  13. SSH在微生物研究中的应用 • 检测毒力岛，寻找毒力有关基因 • 不同菌株的表达不同，及同一菌株在不同环境下表达的不同 • 可移动的遗传因子的变化 • 检测的探针

  14. SSH技术的缺陷 • 表达量很低的差异mRNA也很难被扩增。所以一些量少的基因不作为SSH的检测对象，如转录因子，细胞因子，受体等。 • 要检测出表达量的不同要高于5倍才行。 • 一些重要的差异基因可能会漏过。 • SH无法将两个菌的不同基因都测出，得到的产物不全是差异基因。要考虑用其他技术补充。

  15. 基因芯片 • 原理

  16. 应用： • 微生物比较基因组学研究 e.g. E.coli Distribution of deletions among strains of E.coli Ref: Ochman H & Jone IB. EMBO J,2000;19:6637-6643.

  17. 微生物基因表达谱研究 e.g. Species Experimental design Reference H.pylori NTU-D1 PH 5.5 versus PH 7.2 Ang S ,et al.(2000) E.coli K-12,MG1655 oxidative stress,H2O2 Zheng M, et al.(2001) E.coli K-12,MG1655glucose versus acetate Oh MK, et al.(2002) B.burgdorferi Rat, peritoneal cavity Revel AT,et al.(2002) …… • 微生物检测鉴定研究 e.g.通用检测芯片 耐药性检测芯片

  18. 问号钩体基因组DNA芯片的研制 ♦问号钩体基因组DNA芯片的制备 引物设计 靶序列的制备 点样 ♦问号钩体基因组DNA芯片的应用 钩体比较基因组研究（CGH） 钩体转录组研究

  19. Query ORF Blast search homologous Blast hits unique …… Dynamic programming Sequence pool Output Global alignment Gapless alignment TGATTTCACTA Primer3 CTAAGCTATCC Gene-specific fragments …… Primers 引物设计 • PRIMEGENS进行引物设计的原则 Ref: Xu D, Li GS, Xu L, et al. Bioinformatics,2002;18(11):1432-1437.

  20. 引物设计的参数及输出结果 • 参数 • 引物长度18bp-24bp • GC含量35-60%，并具有较为一致的Tm（55℃±3℃） • 最小形成发夹结构及二级结构的可能性 • 产物长度250bp-1200bp • Blast的参数：simmax=0.75; lmin=100nt;Emax=10-15 • 引物设计输出结果 • 正向、反向引物 • 起始位置 • 终止位置 • 退火温度 • 产物长度 • 目的基因长度 • 特异性片断的长度

  21. 靶序列的制备 • PCR反应条件 100µl反应体系： 10mM Tris-HCl (pH 8.0) 50mM KCl 2.5mM MgCl2 0.2mM dATP、dCTP 、dGTP、dTTP 3 U Taq DNA聚合酶 引物各10pmol 20ng模板DNA • PCR反应结果 对于问号钩体赖型赖株（#56601）的 3512个ORF（序列长度>250bp），共成功设计3300对引物。经二轮PCR反应及重新设计引物后共扩增出3290个产物。

  22. PCR产物纯化后的部分电泳图 PCR产物纯化后的部分电泳图（1-48为PCR产物；M为DNA Marker DL2000）

  23. 点样 • 384板组板 • 现有3290条PCR扩增产物，组成9块384板。 • 对照样品独立组成1块384板，包括1个定位点，19个阳性对照点 及10个阴性对照点。 共10块384板。 • 点阵排布 • 芯片点样仪为Genemachine，点样针为狭缝针，片基采用氨基化玻片。 • 所有样品排布于 12个亚矩阵中，且每张芯片上重复点样三次。 • 亚矩阵：由18×18的点阵组成。

  24. 问号钩体基因组DNA芯片的组成 • 钩体赖株在GenBank中共注释了4727个基因，钩体DNA芯片上共包含了3528个ORFs，每个ORF在芯片上有三个重复。每张芯片还包含了相应的阳性对照点（钩端螺旋体代谢相关基因）及阴性对照点（棉花和人的基因）。

  25. 参考株#56601菌DNA标Cy3的单色自身杂交图 亚矩阵1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 重复1 重复2 重复3

  26. （一）探针标记和芯片杂交 • 钩体28℃培养至对数生长期 • 抽DNA,进行荧光标记 • Reference: 赖株 • Sample：其他检测株钩体 • 每个检测株钩体进行2次芯片杂交，第一次Sample标记Cy3； Reference标记Cy5。第二次标记相反。

  27. 检测株澳洲型65-9株DNA标Cy3 +参照株赖株DNA标Cy5的杂交图 检测株澳洲型65-9株DNA标Cy5 +参照株赖株DNA标Cy3的杂交图

  28. （二）数据分析 • 芯片上荧光的信号强度用 Genespring software 4.0的中值法进行归一化处理。 • 用Excel软件计算各信号点上检测株与参照株比值，即S/R ratio值。每个ORF取3个ratio值的中值作为最终ratio值。两次实验中log2 ratio值均小于cutoff值时作为缺失基因。 • 去除无效点： FLaiMedian-BLaiMedian-2×BLaiSD ＜0

  29. （三）确定cutoff值 • 以中赖各基因为提问序列，与Fiocruz L1-130株全基因组序列进行blastN，取分值最高区域并计算H值。 H value：[(length of highest-score region) ×(identities )] / (length of query sequence) • 如比较结果中没有E值小于0.01的同源序列，H值设为0。 • 根据H值和赖株与Fiocruz L1-130株杂交结果来确定cutoff值。

  30. 在利用基因组DNA芯片进行比较基因组学研究时，首先要确定基因缺失的筛选标准－cutoff值。在利用基因组DNA芯片进行比较基因组学研究时，首先要确定基因缺失的筛选标准－cutoff值。 • 确定cutoff值最常用的方法是选取已完成全基因组测序且在遗传学上与制备芯片的参考菌株相近的某一菌株作为待测菌，用blast和芯片杂交法分别预测待测菌相对于参考菌所缺失的基因。通过比较两种方法的结果，来确定cutoff值。 • 2003年问号钩体Fiocruz L1-130株在巴西完成测序。

  31. 芯片上各ORF的H值和杂交信号关系

  32. 取cutoff值为－1.585。 • 假阴性为0（0/3131），假阳性为3.3％（2/61）。 • 两次实验S/R(检测/参照) ratio均0.33的基因作为在检测株中缺失/非保守基因。

  33. （四）芯片杂交结果 • 有275个基因在11个检测菌中至少有一株菌中缺失，占芯片中所有ORF的7.9％ 。 • 2,917个基因在所有检测菌中均保守 。

  34. 各菌株缺失基因数

  35. 钩体芯片杂交后缺失基因分布情况

  36. 问号钩体赖型在28℃和37℃两种不同的体外培养温度下基因转录情况的变化问号钩体赖型在28℃和37℃两种不同的体外培养温度下基因转录情况的变化 • 问号钩体在28℃和37℃培养至对数生长期后提取RNA，分别用Cy5和Cy3标记并与芯片杂交,并重新抽提RNA重复实验一次。 • 根据通用筛选标准（ratio*值>2者或<0.5为表达上调或下调的基因）进行统计，取两次重复都发生相同变化的基因进行统计，结果表明问号钩体在两种不同的培养温度约有3.5％基因的转录情况发生了较显著的变化。

  37. 问号钩体37℃RNA标Cy3+ 28℃RNA标Cy5的杂交拟合图

  38. Jin-hong Qing, et al. BMC Microbiology 2006, 6:51

  39. Microarray 特点 • 规模化检测 • PCR基础的microarray 不能检测到点突变和嵌合基因 • 存在一定假阳性率和假阴性率，需用其他方式验证

  40. 新一代测序技术在表达谱分析分析上的应用 • Solexa测序服务采用Illumina Genome Analyzer系统。 • SOLiDTM 3 系统是由AB公司研发的新一代超高通量基因测序分析系统，可运用到多个领域。

  41. Illumina's Solexa Sequencing Technology • Solexa测序技术采用大规模并行合成测序法(SBS, sequencing-by-synthesis)，可以同时完成传统基因组学研究（测序和注释）以及功能基因组学（基因表达及调控，基因功能，蛋白/核酸相互作用）研究。 • 大大降低了测序成本，同时提高了测序效率； • 每个flow cell有8个通道，每个通道可单独运行一个样品，也可以把多个样品混合在一起检测； • 一次单通道的测序可以获取至少500万个读数 • 每次运行实验可读取10亿个碱基/flow cell  • 可精确读取重复序列； • 无需建库，自动化样品制备，简单，成本低； • 样本使用效率极高，所以对少量样本也可以极灵敏精确地检测 • 每次测序长度为30 bp左右 

  42. 原理

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