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俺怎么越看越象

NH2. COOH. 俺们的进山全家福， hoho. 俺怎么越看越象. 乒乒乓乓，不要扔西红柿～～～ -_-b. 每一种离子的分布都满足 Boltzmann 分布函数 第 i 种离子 density profile:  (x)i =  i e -Zi e (x)/kT 接近表面处( x=0) ：  oi =  i e -Zi e o/kT 其中： Zi 为第 i 种离子的离子价 ( x): electrostatic potential at x

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俺怎么越看越象

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Presentation Transcript

  1. NH2 COOH 俺们的进山全家福，hoho 俺怎么越看越象 乒乒乓乓，不要扔西红柿～～～ -_-b

  2. 每一种离子的分布都满足Boltzmann分布函数 第i种离子density profile: (x)i = i e-Zi e (x)/kT 接近表面处(x=0)： oi = i e-Zi e o/kT 其中： Zi为第i种离子的离子价 (x):electrostatic potential at x o为表面电势(x=0处的(x)) e为电子电荷 i为第i种离子的体浓度

  3. 7.生物膜的离体研究

  4. 生物膜的离体研究 • 脂单层方法 • 支撑脂双层方法 • 平面脂双层(黑脂膜)方法 • 脂质体方法

  5. 脂单分子层技术 Langmuir膜 兼性分子在空气与水的界面上形成的单分子层。 Langmuir-Blodgett (LB)膜 气/液界面单层膜转移到固体表面上形成的薄膜(单层或多层)。

  6. 空气 水 典型的能形成LB膜的分子： 硬脂酸分子(兼性分子)的结构及模型

  7. 脂单分子层技术 Langmuir膜的铺展 将要铺展单层膜的兼性分子溶于适当的易挥发性有机溶剂中，滴加在适当的亚相上，待有机溶剂挥发掉以后，在亚相表面就悬浮着一层兼性分子。

  8. 脂单分子层技术 气液界面上Langmuir膜制备装置示意图

  9. 脂单分子层技术 LB膜制备装置示意图

  10. 垂直提拉法制备LB膜 将单层膜保持在一定的压力下，用事先处理好的固体载片沿着垂直方向缓慢地伸入和提拉出亚相，单层膜就会被连续地转移到固体表面上。 疏水衬底提拉(左) 妾水衬底提拉(右)

  11. 水平提拉法制备LB膜 将表面经过疏水化处理的载片水平地放在亚相表面，使单层膜吸附转移到载片表面。

  12. 脂单分子层技术 表面压  由于气/液(如水)界面单分子层的存在，使液相的表面张力由 0降低为 ，定义表面压为  = 0 - 

  13. 脂单分子层技术 单层膜的-A曲线 在等温条件下改变膜太平的挡片的位置，并记录  的变化。以  对分子的平均面积作图，得到单层膜的曲线(等温线)。

  14. G: 气相 (二维理想气体状态 方程：A = kT ) L-G: 气相-液相共存 L: 液相 (状态方程： (A-Ao) = kT ) M: 凝胶相-液相共存 S:固相 由于单分子层除了层内分子间的相互作用外还有层内分子与底部亚相中的液体分子之间的相互作用，这就使得单层膜可能出现一些中间状态，与这些中间状态相似的三维空间的相态至今还未发现过。 单分子层 -A 曲线(等温线)示意图

  15. Idealized isotherms of pressure () versus area (A) relationship of phospholipid monolayers showing different phases and coexistence regions.

  16. Pressure-Area isotherms of monolayers of DPPC on water at the temperatures indicated.

  17. 使用单层膜检测A40的插膜

  18. 单层膜检测A40与A28插膜的比较

  19. 单层膜检测胆固醇对A40插膜的影响

  20. 单层膜检测A40插膜的膜组分依赖性

  21. 脂单分子层技术 表面收集法测量界面蛋白浓度原理图 Wang等人设计了一套真空吸取的办法(Biophysical J.83(2002)985-993)，待荧光标记的蛋白达到插膜平衡之后，将部分单层膜连同粘着的体相溶液收集，然后通过荧光强度的测量确定界面蛋白浓度。

  22. 脂单分子层技术 倒置式荧光显微膜天平的结构原理示意图

  23. 荧光显微镜膜天平技术观测脂膜的相分离和运动荧光显微镜膜天平技术观测脂膜的相分离和运动

  24. LB膜在生物学中的应用 (1)脂类之间及脂类/蛋白之间相互作用的研究 -A 曲线， -t 曲线，荧光显微膜太平 (2) 配体与受体间的分子识别 (3) 膜的粘着与融合 (4) 蛋白质的二维结晶化 (5) 生物传感器和生物芯片

  25. Two-dimensional crystallization of avidin on biotinylated lipid monolayers

  26. 生物膜的离体研究 • 脂单层方法 • 支撑脂双层方法 • 平面脂双层(黑脂膜)方法 • 脂质体方法

  27. 固态支撑膜 四种不同类型的固体表面支撑膜 (A) 支撑脂双层与固体表面间由一层约1nm厚度的超薄水层分隔；(B) 支撑双层的内层与固体表面通过静电作用或共价键直接结合；(C) 支撑双层与固体表面间由一层超薄的软多聚化合物分隔；(D) 在固体表面先藕联上超薄的多聚物层（如dextran），然后再通过共价藕联将蛋白与多聚物结合在一起形成蛋白支撑膜。

  28. 固态支撑膜 制备支撑双水分子层的3种方法 (1993) a) LB 技术 b) SUV在亲水衬底上融合 c) SUV在疏水脂单层表面融合

  29. 固态支撑膜 • 固体衬底表面生物功能化的方法 • 如果要固定多聚物，如Dextran，可以先在表面上沉积一层带有功能头基（如环氧基，氨基，腈基）的长链表面活性剂单层膜和乙醇，乙醇的目的是使表面亲水化，以防非特异性的蛋白吸附。 • 通过活化的酯（如琥珀酰胺），将其结合到脂质或聚合物链上，而蛋白上则化合上氨基，氨基与活化脂间结合将蛋白固定。这种方法很适合固定抗原表位或Fab片断。 • 在镍或铜离子存在的情况下，NTA(Nitrilotriacetic acid)与寡聚组氨酸可以形成稳定的鳌合物。利用此原理，制备鳌合脂质NTA-lipid，在二价离子（如Ni2+, Cu2+）存在时鳌合脂质与含有寡聚Histine的蛋白能结合。

  30. 全内反射荧光技术

  31. Schematic illustration of controlled assembly of biotin-lipid containing monolayer/avidin/biotin-ssDNA complex on solid support (a) and the related SPR spectra (b).

  32. Supported membranes as “ phantom cells” Incorporation of charged lipids, gangliosides, and receptors into supported bilayers allow control of electrostatic, polymer-induced, and lock-key forces (Science 271(1996) 43-48)

  33. RICM visualization of a DMPC vesicle containing 1 mol% biotin-labeled lipid as the receptor interacting with a surface covered by streptavidin. The formation of adhesion plaques is caused by interplay of the strong attraction between receptors and the repulsive undulation forces.

  34. 生物膜的离体研究 • 脂单层方法 • 支撑脂双层方法 • 平面脂双层(黑脂膜)方法 • 脂质体方法

  35. 为什么叫“黑脂膜”？ 显微观察磷脂成膜情况

  36. 测量参数：电阻 电容 Schematic representation of the experimental set-up for the formation of BLM by painting a film of lipid on a hole on Teflon cup.

  37. 制备BLM的脂溶液 为了要模拟生物膜的脂组分，故BLM是从需要模拟的组织器官提取磷脂或鞘脂的。用得较多的有从脑组织提取的脂，叶绿粒抽提物，胆固醇，氧化胆固醇以及纯的PC，PE，PS等。 BLM制备液一般应将高度纯化的磷脂溶于碳氢溶剂，例如癸烷，辛烷，苯，氯仿或乙醇等。有时也用鲨烯作溶剂，因为鲨烯会在BLM形成过程中被排挤出来，使BLM成为无溶剂的BLM。这种BLM更接近自然生物膜的基架。一般情况下溶剂碳氢链在C6一CI16间较适宜，它们在室温时都是液态，极少溶于水。 BLM制备液中如含有杂质就不易铺制出BLM。

  38. 对称BLM的铺制 实验槽中间以聚四氯乙烯作为隔板（BLM支持物），隔板中间开一小圆孔，面积一般不要超过0.25平方厘米。 槽内放上适当的缓冲溶液，把小孔浸没。然后把一滴BLM制备液加到隔板的小孔下方（用毛刷或微量注射器）。由于聚四氯乙烯具有良好的亲脂疏水性，故脂较容易附在小孔四周，并扩展过整个小孔，随后脂滴的中间部分慢慢变薄，最后成为双分子层，而沿着小孔四周则积有较厚的脂层，成为一个圈，它对BLM起支持作用，这一圈称P－G边界（Plateau－Gibbs border）。 脂滴在小孔中形成双分子层脂膜是一个自发的渐变过程。通过光学或电学的方法可以验证双分子层是否已经形成。

  39. 毛刷法铺制对称BLM

  40. 不对称BLM的制备(1) The formation of BLM by apposing two monolayers on a hydrophobic partition by raising the level of the aqueous phase on which a monolayer has been formed.

  41. 由单层合成双层的BLM铺制法 隔板固定而使两侧溶液液面移动的方法：使两个可以同步推进的注射器与聚四氟乙烯隔板两侧的溶液连通并使左右液面保持在同一水平上。同步推进注射器，使两侧液面升至小孔下方2－3毫米处。在两侧溶液面上分别滴加BLM制备液，BLM制备液在液面扩展为单分子层，此时再使二注射器同步推进，使二侧面上升经小孔而达小孔上方2－3毫米处方才停止。当二侧脂单层上升经过小孔时，合而形成脂双层。如果脂溶剂是易挥发的，这样形成的BLM还能做到不含脂溶剂。 另一相似的方法是使聚四氟乙烯隔板可以上下移动，但仍能保证左右两侧之间有良好的绝缘性。铺制时先将隔板向上提起，使小孔上升至液面之上，将BLM制备液分别滴在左右两侧的水面上．脂即在水面上扩展为脂单分子层。如果在两侧水面上铺展不同的脂，则两边的单分子层就不对称。然后将隔板向下移，当隔板的小孔移到液面下时，很自然地在小孔上就形成了双分子脂层。 铺成的BLM并不是静止不动的，双层的脂分子是流动的，两侧不同的脂分子在P－G边界中会混合在一起，而P－G边界中的脂分子是会同双分子层中的脂分子通过流动而进行交换的，最后在BLM中的脂也就不可能保持不对称了。但是这种方法可以确保BLM两侧溶液不会混合，因而可以进行膜两侧溶液不对称时的各种研究。

  42. 不对称BLM的制备(2) The formation of BLM by apposing two monolayers on the tip of a micropipette by first removing the tip from the aqueous phase on which a monolayer is present, and then reinserting the tip through the monolayer.

  43. 在滤纸的微孔中形成BLM 在显微镜下观察滤纸，可以看到上面有许多微孔。有人把滤纸先用脂浸泡，然后取出晾干，这样滤纸就具有亲脂疏水特性。用这种脂处理过的滤纸放在聚四氟乙烯隔板的部位取代聚四氟乙烯隔板（当然要有特别设计的夹具，把滤纸夹在左右二室之间）。然后用前面介绍的方法铺制BLM，实践证明在滤纸的许多小孔上都形成了BLM，只是每个BLM的面积小，但是许多小面积的BLM加起来就比单个“大”孔上铺成的BLM还大。

  44. 生物膜的离体研究 • 脂单层方法 • 支撑脂双层方法 • 平面脂双层(黑脂膜)方法 • 脂质体方法

  45. Temperature induced shape changes of vesicles (1990). (a) Transition of a vesicle from a biconcave shape (center) to an invaginated (stomatocyte) shape (left side) at decreasing temperature and to a budded shape (right side) at increasing temperature.

  46. Shapes of vesicles (or cells) on the basis of the bilayer coupling hypothesis model (1983): The different cell shapes can be explained in terms of two parameters: 1) the reduced volume v=v/vs: the ratio of the actual volume of the cell to that of a sphere, 2) the relative area difference =(A0-Ai)/(A0,s-Ai,s) where A0 and Ai are the areas of the outer and inner leaflet of the membrane and where A0,s and Ai,s are the corresponding values of the sphere. Shape transformation of giant vesicle triggered by temperature changes. The transitions are completely reversible !

  47. Phase contrast micrographs of shape change of composite shell (1998). DMPC vesicle containing 2M of actin (image a and b) and 7  M(image c and d) of actin.

  48. 脂质体的类型： SUV： 小单片层脂质体(small unilaminar-) MLV：多片层脂质体(multilayer-) LUV: 大单片层脂质体(large unilaminar-) 脂质体是由脂质双分子层组成的内部为水相的闭合囊泡。

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