动物细胞培养基本技术与原理

1. 动物细胞培养基本技术与原理

2. 细胞与组织培养（体外培养）(cell and tissue culture)： 从机体中取出组织或细胞，模拟体内生理条件在体外进行培养，使之生存和生长。 包括三个层面：器官培养、组织培养、细胞培养 分别代表细胞水平、组织水平或器官水平的培养

3. 主要讲3方面问题： 动物细胞培养的主要领域及意义 动物细胞的培养特性 动物细胞培养的生存条件

4. 一、动物细胞培养的主要领域及意义 单克隆抗体与现代医学 动物胚胎孵育与畜牧业 动物细胞培养与现代医药业 动物克隆的广泛应用

5. 1.单克隆抗体技术与现代医学 单克隆抗体技术步骤：* 骨髓瘤细胞(myeloma cell) 特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞(antigen stimulated B lymphoblast)融合 杂交瘤细胞(hybridoma cell)。

6. 杂交瘤细胞的特性：* 既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。 单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术(hybridoma technology)。

7. 单克隆抗体的特性：* 具有高度的特异性、灵敏性与准确性 应用：临床医学的疾病诊断。 生产各种免疫疫苗。 用于某些肿瘤的治疗。 用于各种基础医学研究。

8. 2.胚胎孵育与畜牧业 农畜动物胚胎移植：利用胚胎技术大批量生产优质胚胎，从而可以 降低胚胎成本，扩大移植胚的来源。 体外受精：加快农畜良种化。利用体外受精技术进行核移 植、性别控制和基因导入，工厂化生产遗传性状稳定、生 产性能优良的家畜。

9. 类 型 动物细胞培养的产物 人疫苗 小儿麻痹症、狂犬、风疹、脑炎、乙肝表面抗原、疱疹、某些癌症 动物疫苗 口蹄疫、鸡瘟病、猪霍乱、马脑炎、牛痢疾、犬瘟、草鱼出血病 酶 尿激酶、细胞色素P450、胃蛋白酶、胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原激活剂、胶原酶、酪氨酸脱羧酶 激素 促红细胞生成素、促间质细胞激素、绒毛膜促性腺激素、促黄体激素、促滤泡激素、生长激素 免疫调节因子 白细胞活化因子、转移抑制因子、胸腺素、白细胞介素、干扰素、血清胸腺因子、巨噬细胞毒力因子、β-细胞生长因子 3.动物细胞规模化培养与现代医药 抗体药物 治疗性抗体

10. 4.动物克隆技术有益应用 动物克隆技术的应用前景： （1）保存优良的动物品种 （2）拯救濒临灭绝的珍惜动物 （3）利用克隆动物工厂生产蛋白质药物 （4）利用克隆技术生产人体器官

12. 二、动物细胞特性 动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性

13. 1. 动物细胞在活体内的特性 增殖 分化 　　在活体内，动物细胞: 　　分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有明显的形态学特征。 如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。

14. 活体内的动物细胞按照分裂能力可以分为三大类： • 第一类是能保持继续分裂能力的细胞，可以继续不断地分裂，如骨髓干细胞、各类前体细胞； • 第二类细胞群是永久失去分裂能力的细胞，如各类高度特化的细胞； • 第三类是静止细胞群，即所谓的G0细胞，在正常情况下，它们不分裂，也不合成DNA，但在受到刺激后，则重新进入细胞分裂。如人的肝脏细胞等。 • 第一类和第三类细胞在适当条件下可进行离体培养。

15. 2. 培养条件下动物细胞的生长特性 • 离体培养的动物细胞可分为： • 贴壁依赖型(anchorage-dependent) • 非贴壁依赖型(anchorage-independent) • 兼性贴壁细胞

16. 1）贴壁依赖型 简称为贴壁细胞，包括成纤维细胞型、上皮细胞型、游走细胞型、多形性细胞型。 成纤维细胞型 细胞形态与体内成纤维细胞形态相似，胞内呈梭形或不规则三角形，中央有园形核，胞质向外伸出2～3个长短不同的突起。细胞群常连接成网，生长时呈放射状或火焰状。除真正的成纤维细胞外，心肌、平滑肌、成骨细胞培养时均属这一类型。

17. nerve cell 游走细胞型在支持物上分散生 长，不连接成片，细胞胞质常伸出 伪足或突起，呈活跃的游走和变 形运动，速度快而方向不规则。在 一定条件下，可转变为成纤维细胞 型。 多形性细胞型某些组织和细胞， 如神经细胞，难以确定它们的稳 定形态，可统归于多形细胞型。

19. 2）非贴壁依赖型 也称悬浮型，这类细胞培养时不贴附于支持物上，可在培养液中悬浮生长。来源于血液、淋巴组织的细胞，许多肿瘤细胞等均属于此类，细胞一般呈圆形。 3）兼性贴壁细胞 动物细胞培养中，有些细胞呈现双重性，既可以贴壁生长，也可以悬浮培养，如中国地鼠卵巢细胞、小鼠L929细胞等。

20. 4. 培养条件下动物细胞的生理特点 1）动物细胞的分裂周期长 动物细胞分裂周期一般为12～48小时，它不仅随细胞种属的不同而有差异，即使是同一种属，不同部位的细胞所需的时间也不同。此外，培养条件如温度、pH、培养基的成分等，也会影响分裂周期的长短。

22. 2）接触抑制(contact inhibition)现象 除少数悬浮培养细胞外，大多数正常二倍体细胞的生长都需要在一定的基质（如玻璃、塑料等）上贴附，伸展后才能增殖。当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片即每个细胞与其周围的细胞相互接触时，细胞就停止增殖，即细胞密度不再增加，这一现象称之为接触抑制或密度依赖抑制现象。

23. 3）有限细胞系和永久细胞系 动物细胞离体培养起始物--原代培养（primary culture） 经继代培养后即成为有限细胞系(finite cell line)。有限细胞系即使培养条件均能满足细胞繁殖生长，它们也只能在有限的时间内生存，一般经过30~50世代后细胞将逐渐死亡。

24. “代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。

25. 大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。 永久细胞系有如下特征： 细胞形态变化，如细胞变小，黏附性减少，具有较高的核质比； 生长速率增加，倍增时间缩短；对血清的依赖性减小； 贴壁依赖性降低；细胞异倍体和非整倍体增加，细胞接种到体内后，生癌率上升。永久细胞系的建立是动物细胞规模化培养的前体。

26. 4）动物细胞的环境敏感性 动物细胞与微生物和植物细胞相比，其培养难度要大一些，其主要原因是动物细胞只有细胞膜，而没有细胞壁的保护。 动物相比对培养环境十分敏感，一切影响细胞膜变形的因素都会影响动物细胞存活。 动物细胞培养对营养条件的要求也十分复杂。

27. 三、动物细胞的环境要求

28. 1. 动物细胞培养的环境要求 1）无污染环境 2）温度 昆虫细胞培养温度一般是25～28℃ 哺乳动物细胞的培养温度一般是37℃。 总体上讲，动物细胞忍受低温的能力比忍受高温的能力强。如哺乳动物细胞在45℃下只能存活1小时，但在25℃条件下仍然能慢速生长，并维持长时间不死，甚至在4℃下数小时后，再置于适宜温度下细胞仍然可以正常生长。液氮冻存。

29. 3）pH 动物细胞培养适宜的pH一般在7.2-7.4，低于6.8或高于7.6都不利于细胞生长，严重时会导致细胞死亡。 培养细胞对pH的要求因培养时间长短有关，一般原代细胞要求较严格，而永久细胞系对pH具有较强的忍耐性。

30. 4）气体环境及溶氧 一般细胞在培养初期要求较低的溶氧水平，而在对数生长期或培养后期，对溶氧水平要求增加，如果供氧不足，将导致细胞缺氧而死亡。 除了氧气供应外，还应注意培养基的氧气和CO2的平衡。

31. 5）渗透压 动物细胞培养渗透压包括两个方面的问题： 培养基的渗透压维持 细胞体内的渗透压维持 大多数动物细胞对渗透压的忍耐程度较强，只要培养基的渗透压变化不是很剧烈，一般对培养物不会造成致命伤害。动物细胞渗透压的维持一般采用平衡盐溶液。

32. 四、动物细胞培养

33. 基本概念和基本步骤: 取材分离和组织消化 细胞计数 常用培养法 细胞的常规检查 细胞系与克隆 动物细胞的大规模培养 细胞的冻存与复苏

34. 一、基本概念（general concept）： 细胞培养（cell culture）：将动物组织或细胞分散成单个细胞，在模拟机体内的生长环境条件下，使其在体外环境继续生长增殖的过程。 原代（初代）培养：指将机体取出的组织或细胞进行初次培养的过程。原代培养的细胞大约增殖10代左右，称为原代细胞。 传代（继代）培养：从原代培养的细胞继续转接培养，称为传代培养。传代培养的细胞称为传代细胞。

35. 二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion ) （一）取材——获取组织 原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录； 所用器皿用前严格消毒灭菌，取材时严格无菌操作。

36. 取材方法: 处死动物 → 取出组织块，放入小烧杯中 → 用尖嘴眼科剪刀 将组织块剪碎（1mm3），用吸管吸取Hanks液冲下剪刀上的碎 块，补加3~5ml Hanks液，用吸管轻轻吹打； →低速离心，弃去上 清液，留下组织块。（也可用手术刀片将组织块切碎，优点：对细 胞损伤较小，缺点是操作时间长，容易污染） → 对某些软组织碎 组织块，可放入注射器玻璃管中或1mm不锈钢/尼龙网筛挤压分离。

37. （二）组织消化(tissue digestion) 用生物化学的方法将剪碎的组织块分散成细胞团或单细胞。 1、常用消化液适用范围 （1）胰蛋白酶：适用于细胞间质较少的软组织，如胚 胎、羊膜、上皮、肝、肾、传代细胞等。 （2）胶原酶：适用于纤维组织、上皮组织、癌组织等。 （3）其他酶：链霉蛋白酶、粘蛋白酶、蜗牛酶等，根据酶的作用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。

38. 2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation) （1）胰蛋白酶消化(trypsin digestion) ①将剪碎的组织块放入有玻璃珠的三角烧瓶中，加入30~50倍体积的0.25%胰 蛋白酶； ②37℃水浴内消化30~60min，每5~10min摇动一次。根据效果可中间更换消 化液。（静止10min，吸去2/3上清液，补加新鲜胰蛋白酶） ③Hanks液漂洗两次，每次2~3min； ④800r/min离心5min，弃上清液，加入营养液。如有大块，可用纱网过滤。 如消化传代细胞，可与EDTA混用。

39. （2）胶原酶消化(collagenase enzymatic digestion ) ①培养瓶中放入1~5mm3大小的碎组织块，加5ml 2000 u/ml的胶原酶溶液，使终浓度为200u/ml，pH6.5； ②36.5℃水浴24~48h，视情况可适当延长，无需摇动。期间可更换酶液一次； ③见组织块已变软，分散于瓶底时，轻微震荡使散成细胞团或单细胞。小心倒出培养液，瓶底可能附着一些巨噬细胞，借此可将其分开（单独培养或弃之不用）； ④800r/min离心5min，弃上清液，重悬于BSS液中，再重复离心一次； ⑤加入培养液制成细胞悬液，用于接种。

40. 三、细胞计数(cell counting) ——计数悬浮液中细胞的形态及浓度，以判断消化或稀释程度（亦用于培养液中细胞浓度的检查） ①染色：在干净的离心管中加入9滴细胞悬液，再加入1滴0.4%台盼蓝，混匀，静置2~3min； ②充池：在计数板盖片边缘加入1~2滴染色的细胞悬液，使之完全充满计数板与盖玻片间的空间（无气泡或溢出）

42. ③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。③计数：在显微镜下记录计数板四角四个大方格中的活细胞（不染色细胞）总数。一团细胞按一个细胞计数。压线细胞，数上不数下，数左不数右。 ④计算： 细胞悬液浓度（细胞个数/ml）=（4大格细胞总数/4）×104×稀释倍数 注意：如细胞团数超过10%，说明消化不充分。 细胞接种浓度：3~10×105/ml

43. 四、常用培养法(general cultivation) （一）组织块培养法( tissue piece cultivation) 将组织块剪切成小块，直接放入培养瓶中，贴附一段时间后，细胞从组织块长出，最终形成单层细胞。

44. 1、悬滴培养法(drop culture)——最简单、最原始的培养法 悬滴培养法缺点：细胞生长空间狭小气体不足，不能持续长时间生长培养基易液化，需要常更新培养基凹玻片折光，不便于观察。

45. 2、旋转管培养法(rotate tube culture) ①组织块或细胞可交替地接触营养液和空气，利于细胞生长； ②培养管缓慢转动，使整个管内壁全部长满细胞，提高了细胞产 量，适于较大量的组织培养和各种长期传代细胞的培养。 缺点：不易在显微镜下观察。 3、灌注小室培养法(dabble boothcultivation) 为大规模培养系统提供了参考原理。

46. 4、卡氏瓶培养法 卡氏瓶(carlsberg's flask)（如下图）： ①将组织块剪碎，BSS漂洗。 ②转移到另一只培养皿，在解剖显微镜下去掉不需要的组织如脂肪、坏死组织等。将组织块切成1mm3小块。 ③用预先润湿的滴管转移到消毒离心管，静置使组织小块下沉，吸去上清。以新鲜BSS漂洗。重复2~3次。

47. ④转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置20~30块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5℃培养18~24h。④转移到培养瓶（每个25ml的培养瓶可放置20~30块组织小块），吸去液体。加入1ml生长培养液，轻斜摆动培养皿，使组织小块均匀分布。盖好瓶盖，36.5℃培养18~24h。 ⑤待组织块粘附瓶壁后3~5天，加入5ml培养液；然后每周更新培养液一次。培养3~5周，细胞不断增长，肉眼或低倍镜下观察可见围绕组织周围生长犹如日晕，称“生长晕”。 ⑥取出中央组织块，用预先湿润的滴管移到另一新的培养瓶。重复④~⑥操作。 ⑦在原生长晕培养瓶内换入新鲜培养液。待生长晕细胞扩展至约50%培养瓶底表面时，进行细胞培养。

48. （二）单层细胞培养法( monolayer method) 组织块经胰酶消化分散成较小的细胞团或单个细胞，在合成培 养液中附在瓶壁上长成单层，即形成所谓单层细胞培养。 1、原代培养(primary culture)（初代培养）

50. 2、传代培养(serial subcultivation) : 传代的理想时期：对数生长期，细胞80~90%或刚刚全部汇合。 方法： ①消化：加入胰蛋白酶或胰蛋白酶与EDTA混合液，盖满瓶底， 作用2~5min； ②检查：如细胞间隙变大，细胞质回缩，则终止消化。 ③终止消化：吸出消化液；加入Hanks液，轻轻转动，洗去残留 的消化液。如单用胰蛋白酶，可直接加入培养液。 ③细胞计数：用吸管轻轻吹打瓶壁，使细胞脱落，制成悬液， 计数并记录其浓度； ④重新稀释接种培养。