come separare questi oggetti

2. come separare questi oggetti 1 3 2 6 8 5 4 9 7 10 11 12 1 3 2 cotone 8 4 lana 5 6 8 4 7 5 pietra 9 10 11 12 Forma Grandezza Densità lana pietra cotone lana lana cotone pietra lana pietra cotone pietra cotone forma 4 6 grandezza 8 5 Densità 7 Differente velocità di rotolamento Differente sedimentazione Diversa grandezza Juang RH (2004) BCbasics

3. Basic Principles of Protein Purification Cell Macromolecule Organelle Homogenization Small molecule Cell Debris Amino acid, Sugar, Nucleotides, etc Protein Nucleic acid Carbohydrate (Lipid) Ammonium sulfate fractionation Size Charge Polarity Affinity Ion exchange, Chromatofocusing, Disc-PAGE, Isoelectric focusing Reverse phase chromatography, HIC, Salting-out Gel filtration, SDS-PAGE, Ultrafiltration Affinity chromatography, Hydroxyapatite Juang RH (2004) BCbasics

5. Schema a Blocchi di un Sistema Cromatografico pompa colonna RIVELATORE Soluzione di eluizione Collettore di frazioni

6. Scambio ionico: separazione in funzione della carica

7. Importanza del pI • -A pH > pI (almeno una unità) la proteina è carica negativamente e si lega a una resina a scambio anionico (SCAMBIO ANIONICO). • -A pH < pI (almeno una unità) la proteina è carica positivamente e si lega a una resina a scambio cationico (SCAMBIO CATIONICO).

11. Eluizione: -Variazione di pH -Variazione forza ionica -ioni competitivi • Scambiatrice di anioni: • pH decrescente • -forza ionica crescente • -anioni competitivi Scambiatrice di cationi: -pH crescente -forza ionica crescente -cationi competitivi

13. VANTAGGI Per grandi volumi, Grandi quantità di proteina (1-5 g proteina per 100 ml), Matrice molto robusta, Condizioni molto flessibili, possibili molte variazioni. Cromatografia di scambio ionico • SVANTAGGI • Proteine allo stesso pH e concentrazioni di sali della colonna. • Ciò può essere scomodo poiché poi occorre passare in dialisi per togliere i sali.

14. GEL FILTRAZIONE

19. Gel filtrazione

20. Una proteina sconosciuta eluisce a 170 mL: 40,000 Da (40KDa)

21. Cromatografia di affinità Resina Braccio spaziatore Ligando

22. Cromatografia di affinità • Un ligando ad alta affinità per la proteina è legato alla matrice • La proteina di interesse si lega al ligando e viene immobilizzata sulla colonna • Le altre proteine vengono “lavate” via. • La proteina di interesse viene eluita usando una soluzione di ligando.

23. VANTAGGI Alta affinità, costanti di dissociazione nell’ordine del mM, nM o anche pM. Legame tutto o nulla: Possibili molte variazioni (affinity tags) Cromatografia di affinità • SVANTAGGI • L’ingombro sterico spesso abbassa la capacità • Il braccio spaziatore può avere influenza sul legame • L’eluizione può richiedere un eluente specifico

24. Gli affinity tags sono si ottengono attraverso la preparazione di proteine ricombinanti. Alla proteina di interesse è legato un tag che presenta affinità con un ligando: Affinity tags • LIGANDO • Glutatione • Maltosio • Avidina • Nichel, Zinco • Anticorpi • TAG • GST • MBP • biotina • Poli-His • Proteina A • Le proteine contenenti affinity tags sono poi isolati per cromatografia di affinità con i ligandi legati alla colonna. • Le proteine isolate possono poi venire primate degli affinity tag attraverso proteolisi specifica.

25. Cromatografia di affinità con anticorpi

26. Matrici attivate per immobilizzare uno specifico ligando

27. Protocollo generale di purificazione proteine

28. Obiettivi: • Cattura • Isolare, concentrare e stabilizzare la proteina bersaglio • Purificazione intermedia • Eliminare la maggior parte dei contaminanti • Polishing • Ottenere la massima purezza possibile

29. CONTROLLO DELLO STATO DI PURIFICAZIONE MEDIANTE ELETTROFORESI

31. Gas cromatografia (Cromatografia di ripartizione gas-liquido)

32. Schema a blocchi di un gascromatografo

33. Esempio – separazione gas-cromatografica di urina di paziente con elevata aciduria