Биоиндикатори- предавање 2 5 . Микроорганизми као биоиндикатори

1. Биоиндикатори- предавање 2 5. Микроорганизми као биоиндикатори 5.1. Улога микроорганизама у природи - микроoрганизми: једно- или вишећелијски организми, видљиви само кроз микроскоп, величине 0,2 до 200 μm (< 0,2 mm) - категорија укључује гљиве, бактерије, протозое и алге - најраширенија категорија живих бића на Земљи - у земљишту, води, ваздуху, преко 1000 метара дубоко у литосфери, аеробним и анаеробним срединама, арктичком леду и на високим температурама - адаптирали се на живот у готово свим условима - добијају Е из светлости или оксидацијом хемијских супстанци - донори електрона могу бити органске или неорганске супстанце - извор угљеника могу бити СО2 или комплексна органска једињења - микроскопске алге и фитопланктони- главни произвођачи биомасе у воденим системима 1

2. Биоиндикатори- предавање 2 - у морима и океанима бактерије углавном разлажу супстанце које награде фитопланктони, као и њихове ћелијске остатке - бактеријска секундарна продукција чини само 20% примарне продукције фитопланктона - иако хетеротрофне бактерије могу да имају висок степен раста, измене у укупном броју врста бактерија су релативно мале - захваљујући протозоама, број брзомножећих маринских бактерија (величине 0,2-2 μm) у једном истраживању је остајао < 1х106/ml - у водама, главни организми који конзумирају бактерије су хетеротрофни флагелати (величине 2-20 μm) 2

3. Биоиндикатори- предавање 2 - њих конзумирају веће протозое, попут цилијата - они су исте величине као фитоплантони (20-200 μm) - преко бактерија и протозоа се енергија коју су кроз стварање органске супстанце створили фитопланктони враћа у ланац исхране - више биљке су главни произвођач биомасе у терестријалним екосистемима - преко остатака биљака, али и коренског система, настала енергија и угљеникова једињења долазе у земљиште - гљиве и бактерије су главни разграђивачи мртве органске супстанце 3

4. Биоиндикатори- предавање 2 - ту се, пре свега, мисли на остатке биљака, супстанце лучене из корења, мртве микроoрганизме, остатке животиња у земљишту - ове врсте микроорганизама су извор хране за протозое и нематоде, играју главну улогу у ланцу исхране и кружном току хранљивих супстанци - минерализацију, тј. разградњу биополимера у СО2, Н2О, минерални N и P и друге минералне елементе, изводе углавном микроорганизми - минералне хранљиве супстанце које настају разлагањем су у земљишту доступне биљкама и микробима - настаје нова биомаса, а хранљиве супстанце круже - пољопривредно земљиште (0-25 cm) дубине садржи око 3000 kg биомасе по хектару - микроби су доминантни у хемијским и физичкохемијским процесима у таквом земљишту - одговорни за преко 80% укупне активности и процеса 4

5. Биоиндикатори- предавање 2 - у обрадивом земљишту микроорганизми годишње разложе око 5000 kg угљеника по хектару - такође произведу око 100 kg минералног азота - заправо задовоље 50% потребе за азотом пољопривредних култура - микроби и такође утичу на формирање и очување структуре земљишта 5

6. Биоиндикатори- предавање 2 5.2. Зашто користимо микроорганизме као индикаторе? - микроорганизми су корисни индикатори у биомониторингу - присутни су у великим количинама у свим сферама животне средине - учествују у ланцима исхране и кружном току елемената (N, P, C, S) - незамењиви су живот виших организама - мала величина и висок однос површине и запремине узрокује велики афинитет за ниске концентрације супстрата - дакле, врло су осетљиви и реагују веома брзо на стрес и загађење - микробиолошка активност зависи од збира свих физичких, хемијских и биолошких фактора који утичу на процесе разградње и трансформације хранљивих супстанци - микробиолошки индикатори стога могу да послуже као средства за рано откривање проблема са којима се животна средина суочава - микроорганизми укупно представљају велику количину биомасе - такође су и веома разноврсни 6

7. Биоиндикатори- предавање 2 - често су генетске разлике између неких биљака и животиња мање него разлике између појединих микроорганизама - пошто су широко распрострањени и мале величине, не постоји проблем са узорковањем довољно великог броја микроорганизама - практично је могуће доћи до било ког броја микроорганизама у узорку или било које величине узорка - анализа опасности по животну средину услед загађења хемијским супстанцама се обично заснива на анализи самих ксенобиотика - укупне концентрације служе да се утврди загађење и опасност - међутим, при истој концентрацији, биодоступност једињења може да се разликује од случаја до случаја - у земљишту и седиментима, у случају тешких метала, на пример, биодоступност је обрнуто пропорционална рН, садржају глине и органске супстанце - иако се, дакле, знају неки фактори који утичу, процена биодоступности на основу искључиво хемијских анализа још увек крајње несигурна 7

8. Биоиндикатори- предавање 2 - често се раде различите екстраполације - екотоксиколошке лабораторије обично раде испитивања утицаја чистих супстанци на појединачне врсте - то, међутим, не имитира ситуацију присутну у животној средини - када се тако добијени резултати примене на реалне ситуације, обично се у мањој или већој мери греши - не узимају се у обзир интеракције између различитих живих бића и заједница, као ни ланци исхране који постоје - такође, тестови токсичности обично обухватају леталне или сублеталне исходе базиране на релативно кратком утицају ксенобиотика - њихов утицај често знатно дужи, дани, месеци, године, деценије... - резултати, дакле, слабо релевантни у односу на реалан живот - у лабораторијама акутна, у стварном животу и хронична токсичност - често су ефекти, у случају дугорочног загађења, слабији 8

9. Биоиндикатори- предавање 2 - ксенобиотик се делимично или потпуно дезактивира везивањем за органску или неорганску фракцију земљишта - такође, и микроорганизми се прилагоде, развију одређени степен толеранције - у реалном систему је ретко један загађивач присутан сам - обично постоји више ксенобиотика - лабораторијски модели за мерење адитивне токсичности, истовремене токсичности више супстанци, слабо развијени - коначно, формално загађење често није једини стрес који екосистем осећа - ту су и еутрофикација, ацидификација, исушивање, хладноћа... - још један разлог за непоузданост лабораторијских испитивања - еколошки ефекти стреса укључују и смањење биодиверзитета и сметње у процесима као што су разлагање и кружни ток супстанци - тешко in situ мерити разлагање и минерализацију 9

10. Биоиндикатори- предавање 2 - потребно дуго време инкубације, често године, пре него што, на пример, нагомилавање органске супстанце постане очигледно - потребни су, дакле, осетљиви биолошки индикатори - ипак, уз предности, постоје и проблеми - за разлику од биљака и животиња, код микроба још до краја нису разјашњене све разлике између појединих врста - много различитих врста, 104-105 по граму земљишта - немогуће укључити све микроорганизме у процени утицаја ксенобиотика - углавном се укључују доминанте популације 10

11. Биоиндикатори- предавање 2 5.3. Микробиолошке методе које се користе у биомониторингу - три најчешће информације које се добијају: количина биомасе, активност и диверсификација микробиолошке заједнице - за све три информације користимо различите технике - анализе могу бити рађене са микробима из свих средина - већина касније споменутих метода (микроскопија, уградња 3Н-тимидина, DGGE) потичу из истраживања водених система - примењују се у испитивањима земљишта од 1990-тих - микроорганизми се дуго користе као индикатори квалитета вода - укупан број колиформних бактерија и број фекалних колиформних бактерија се користе за утврђивање загађења пијаћих или вода за купање патогеним бактеријама из пробавног тракта - степен еутрофикације вода се деценијама одређује мерењем броја и заступљености неких врста алги и цијанобактерија 11

12. Биоиндикатори- предавање 2 - мерила се и њихова активност у фотосинтези (производња О2) и у дисању (БПК) - коришћење микроорганизама у земљишту као индикатора почело касније - од 80-тих година прошлог века отпочела брига због утицаја пољопривреде на квалитет земљишта - преко микробиолошких индикатора могуће дати брзу оцену стања - бактерије се, генерално, користе чешће него гљиве и протозое - гљиве и протозое су важне у екосистемима, али се тешко “мере” - још увек се развијају технике за одређивање ДНК гљива - нису рутинизиране ни технике за одређивање биодиверзитета гљива 12

13. Биоиндикатори- предавање 2 5.4. Одређивање количине биомасе микроорганизама - класичан начин за одређивање количине живих микроорганизама је да се посеју на хранљиву културу у стакленом суду - Петри 1887. први описао - бактерије формирају колоније, број зависи и од коришћене културе - око 1% бактерија из животне средине може да се одреди на овај начин - коришћењем микроскопа, као и аутоматизованом анализом снимака, могуће је добити информације о укупном броју, биомаси и морфолошким карактеристикама микробиолошке заједнице - често се обележавају флуоресцентним бојама - други могући метод за одређивање укупне биомасе у земљишту је заснован на повећању екстрактабилног С и N након засићења узорка земљишта парама хлорофома - хлороформ разара ћелијске мембране, тако да садржај ћелија прелази у раствор 13

14. Биоиндикатори- предавање 2 - на основу разлике у односу на контролни, необрађени, узорак, се добија количина биомасе, тј. органског С и N - како се око 50% биомасе екстрахује на овај начин из земљишта, неопходно је користити корекционе факторе - елегантнија и савременија метода је да се уместо хлороформа користе микроталаси. 14

15. Биоиндикатори- предавање 2 5.5. Одређивање активности микроорганизама - микробиолошка активност може бити релативно лако одређена мерењем дисања земљишта под стандардизованим условима у лабораторији - у већини земљишта где је доступност лако разградивих супстанци ограничена, ово захтева 2-6 недеља инкубационог периода - још једна коришћена техника је дисање индуковано супстратом - Substrate Induced Respiration (SIR) 15

16. Биоиндикатори- предавање 2 - мери се повећано дисање (ослобађање СО2) након додавања лако деградабилног супстрата (глукозе), у првим сатима након додавања - дисање ће бити мера одговора, самим тим и мера укупне биомасе - брзина раста бактерија може бити мерена брзином уграђивања 3Н-тимидина у ДНК и 14С-леуцина у протеине - ово се ради током релативно кратке инкубације (1 сат) - праћење оба параметра у једном експерименту омогућује истовремено праћење синтезе и ДНК и протеина 16

17. Биоиндикатори- предавање 2 - садржај ДНК код бактерија је константнији од садржаја протеина - због тога је инкорпорација тимидина боље мерило за брзину раста - ћелије синтетишу више протеина него ДНК - због тога је инкорпорација леуцина за ред величине већа од инкорпорације тимидина, лакше се мери и поузданија је при малим брзинама раста 17

18. Биоиндикатори- предавање 2 - само бактерије инкорпорирају тимидин, али све бактерије не инкорпорирају 3Н-тимидин - све бактерије инкорпорирају леуцин, али леуцин могу да инкорпорирају и други организми - како су обе методе појединачно непоуздане, користе се симултано 18

19. Биоиндикатори- предавање 2 - потенцијална брзина минерализације азота и угљеника може да се одреди симултано, инкубацијом у току шест недеља, при 20 °С, и при влази од 50% у односу на максимално могућну - брзина минерализације се рачуна на основу повећања количине минералног азота након шесте у односу на повећање након прве недеље од почетка експеримента - важно: резултат у првој недељи се не узима у обзир - брзина минерализације угљеника се рачуна на основу количине издвојеног СО2 између прве и шесте недеље - у неким маринским земљиштима, која садрже велике количине СаСО3, мерење издвојеног СО2 није поуздано - рачуна се потрошња О2, рачунајући да један мол О2 потрошеног одговара једном молу развијеног СО2 - наравно, О2 потрошен за нитрификацију се одузима 19

20. Биоиндикатори- предавање 2 5.6. Хемијске технике за одређивање микробиолошког диверзитета - метод отиска липидног маркера (signature lipid biomarker, SLB) је најшире коришћен стриктно хемијски метод за проучавање заједница микроорганизама - липиди у микроорганизмима се налазе у ћелијским зидовима, али и у залихама које микроорганизми стварају у време интензивне исхране - SLB може да, у својој најсавршенијој форми, пружи врло различите податке о заједницама микроорганизама - липиди могу да буду екстраховани, фракционисани и анализирани GC-јем - како анализа свих фракција липида захтева време, обично се само неке фракције анализирају - једна од таквих фракција, фосфолипиди, се не налазе у залихама које микроорганизми стварају, ни у мртвим ћелијама - налазе се искључиво у ћелијских зидовима живих ћелија 20

21. Биоиндикатори- предавање 2 - већина студија користила масне киселине фосфолипида како би сеиспитивала микробиолошка структура - иако појединачне киселине нису често карактеристичне за организам или групу организама, могу бити коришћене као биохемијски маркери - доминирају у појединим таксономским групама и константних су концентрација 21

22. Биоиндикатори- предавање 2 - мерење концентрација фосфолипидних масних киселина екстрахованих из земљишта може да пружи податке о заједницама микроорганизама - показаће структуру, као и који су микроорганизми доминантни - неће дати квантитативну информацију о броју врста/организама - мерење укупне биомасе преко укупне количине фосфолипидних масних киселина или подгрупе одређених дало добре резултате - добра корелација са другим методама за утврђивање укупне биомасе - састав фосфолипидних масних киселина зависи и од типа земљишта, присутне вегетације, климе и начина управљања земљиштем - укупно узевши, ипак добра и осетљива метода - често указује на стрес док друге га методе још не показују - добра метода за мониторинг због једноставности, брзине и могућности за стандардизацију и аутоматизацију - потребно још радити на развоју интерпретације резултата 22

23. Биоиндикатори- предавање 2 5.7. Генетске технике за одређивање микробиолошког диверзитета - различите методе су развијене како би се одредила генетска различитост - ДНК је екстрахован из узорака земљишта, седимената и вода - Добијени ДНК је мултипликован PCR-ом и раздвајан коришењем DGGE (denaturating gradient gel electrophoesis) - ДНК фрагменти једнаке дужине се ставе на гел на коме постоји градијент денатуризационог агенса - током електрофорезе ДНК фрагменти се крећу кроз растући градијент денатуризационог агенса - у зависности од састава ДНК, фрагменти стварају траку на месту одређене концентрације денатуризационог агенса - број ДНК трака зависи од броја генотипова специфичних бактерија - интензитет траке зависи од количине ДНК, тј. количине врсте - друге технике се такође користе 23

24. Биоиндикатори- предавање 2 24

25. Биоиндикатори- предавање 2 - temperature gradient gel electrophoresis (TGGE) - температурни градијент у полиакриламидном гелу денатурише - након тога исти приступ као пре, анализирају се траке и њихов интензитет, уз фотографисање и анализу фотографија - аmplified ribosomal DNA restriction analуsis (АRDRA) - након PCR-а се користи дигестија рестрикционим ензимом, па електрофореза на агарозном гелу - АRDRA показује квалитативне разлике између заједница, али није у стању да пружи податке о броју јединки 25

26. Биоиндикатори- предавање 2 26

27. Биоиндикатори- предавање 2 5.8. Физиолошке технике за одређивање микробиолошког диверзитета - физиолошки приступ анализи микробиолошке популације је заснован на способности заједница да метаболишу различита С-једињења - различита органска једињења, од 31 до чак 95, истовремено појединачно служила као извор угљеника - мерила се брзина прераде једињења - промене у брзини или природи прераде угљеникових једињења означавају промене у метаболизму, а ове могу бити последица стреса - резултат зависи од густине колонија, тј. од броја бактерија које прерађују једињења - препоручљиво да се, када се раде поређења, користи исти број колонија као у студијама са чијим се резултатима врше поређења 27

28. Биоиндикатори- предавање 2 5.9. Референтне вредности - особине микроорганизама не зависе само од антропогеног стреса, већ и од карактеристика земљишта - зависе од рН, садржаја органске супстанце, глине и алумосиликата, количине органске супстанце која може послужити као храна - због тога је неопходно имати слепу пробу, тј. узорак који је изложен свим утицајима који утичу на заједницу, осим антропогеног стреса - уколико то није могуће, покушава се да се земљишни систем опише, ради репродуцибилности и тумачења резултата, кроз неке друге величине - специфично дисање, тј. количина развијеног СО2 по јединици биомасе или однос Сбиомаса/Соргански - овакви стандарди описују земљишни систем, али не могу да реше проблем недостатка слепе пробе 28

29. Биоиндикатори- предавање 2 5.9. Одређивање повезаности између загађења и теренских резултата - до сада описане технике дају могућеност да се одреде квалитативни аспекти екосистема - проблем је, међутим, да се сазна узрок тог квалитета - да ли је квалитет или његова промена узрокован стресом? - који је стрес, и да ли је антропогени стрес у питању? - могуће сазнати статистичком анализом, ако постоји довољна количина података - једна од могућих последица је да се заједница која је изложена прилагоди тако што ће повећати своју толерантност - то је могуће на више начина, физиолошком или генетском адаптацијом, губитком најосетљивијег дела заједнице, реколонизацијом локације толерантним јединкама - pollution induced community tollerance (PICT) 29

30. Биоиндикатори- предавање 2 - корисно за испитивање ефекта загађивача на терену - праћењем промена толерантности се долази до података о реалном утицају који је изазвао повећање толеранције - PICT боље дефинише каузалност него друге класичне анализе 30

31. Биоиндикатори- предавање 2 5.10. Неки аспекти практичне примене - који је ефекат загађивача? - који је укупан ефекат загађивача, начина коришћења земљишта и других узрока стреса на заједницу микроорганизама? - коришћење различитих техника доказало да тешки метали утичу на заједнице микроорганизама - повећање концентрације утиче на дисање у шумским земљиштима, али нема једнозначних резултата за пољопривредна земљишта - генерално, дисање није довољно добар биоиндикатор, јер нема мерљивих промена при концентрацијама испод ЕУ лимита - уграђивање 3Н-тимидина дефинитиво осетљивије према загађивању него промена биомасе или брзина дисања код земљишта и вода - што се тиче гљива, различити истраживачи дају конфузне закључке - неки тврде да су мање, други да су више осетљиви од бактерија 31

32. Биоиндикатори- предавање 2 - када је CuSO4додаван земљишту при рН 5,0, већ при 10 mgCu/kg примећен је пад брзине уграђивања 3Н-тимидина - бактеријска биомаса и брзина дисања су се смањивали при знатно већим концентрацијама (100-1000 mgCu/kg) - брзина раста у овом случају бољи индикатор од биомасе или дисања - експеримент са три различите локације и песковитим земљиштима - једно загађено Cu (максимум 160 mgCu/kg), друго са Ni и Cr (2.800 и 430 mg/kg), треће са Zn (10.000 mg/kg) - на земљишту загађеном Cu, брзине како уградње 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале у односу на земљиште са природном концентрацијом већ од 25 mg/kg - уградња 3Н-тимидина опада при концентрацијама које су ниже од тренутне максимално дозвољeне концентрације у ЕУ (140 mg/kg) - већина других параметара, биомаса бактерија и гљива, протозоа и нематода, брзина дисања и N-минерализација такође опадају са растом концентрације Cu 32

33. Биоиндикатори- предавање 2 - разлике међутим нису статистички значајне, поново је пад брзине раста бактерија најосетљивији биоиндикатор - код земљишта загађеног Ni и Cr, брзина раста бактерија, али и бактеријска биомаса опадају са повећањем концентрације метала - као и у случају бакра, брзине уградње 3Н-тимидина, као и 14С-леуцина су значајно пале, при чему је брзина уградње 3Н-тимидина више опала - генерално, повећане концентрације метала инхибирају синтезу ДНК више него синтезу протеина - код земљишта контаминираног Zn, сви параметри, поготово везани за број и масу микроорганизама, али и брзина минерализације C су били знатно нижи него код земљишта које је ремедирано 33