Průmyslová toxikologie (C867)

1. Testování toxicity průmyslových chemikálií III(dlouhodobé studie subakutní, subchronické a chronické toxicity) Průmyslová toxikologie (C867)

2. Subakutní, subchronické a chronické studie • poskytují informace o možných účincích testované látky na organismus po opakovaném dlouhodobém podání. Význam Typy studií – OECD metody • 407 Orální toxicita (28-denní opakovaná aplikace) • 412 Inhalační toxicita (14, 28-denní opakovaná aplikace) • 410 Dermální toxicita (28-denní opakovaná aplikace) • 408 Studie subchronické toxicity orální (90-denní opakované expozice) • 411 Studie subchronické toxicity dermální (90-denní opakovaná expozice) • 413 Studie subchronické toxicity inhalační (90-denní opakovaná expozice) • 451 Zkouška karcinogenity • 452 Zkouška chronické toxicity • 453 Kombinovaná zkouška chronické toxicity a karcinogenity

3. Obecné podmínky • doporučený druh podle metodiky: potkan, myš (kmen, věk, hmotnost) • samci i samice; aklimatizace minim. 5 dnů • počet: dle metodiky Pokusná zvířata: Podmínky chovu: • teplota 22 ± 3 °C; relativní vlhkost 30 - 70% • osvětlení: 12 hodin světlo/ 12 hodin tma • krmení a voda ad libitum Výběr vehikula: • dle rozpustnosti látky – voda, olivový olej, metylcelulóza • stanovení stability a homogenity aplikované formy

4. Obecné podmínky Dávkové hladiny: • minimálně 3 koncentrace testované látky, kontrolní skupina (pouze vehikulum) • dávky vycházejí z výsledků akutních studií, literatury, popř. z pilotního experimentu s omezeným počtem zvířat • limitní test 1000 mg.kg-1 • satelitní skupiny – zjištění reverzibility změn Aplikace: • orální – žaludeční sondou • dermální – fixace na cca 10% plochy těla • inhalační

5. Klinická a laboratorní vyšetření • kontrola zdravotního stavu laboratorních zvířat a sledování funkčních poruch • stav a reakce kůže, srsti a sliznic • dýchání, sekrety, exkrety, pohyb, reakce na podněty …… Klinická vyšetření: Laboratorní vyštření: • vyšetření moči – barva, zákal, zápach, objem, pH, specifická hmotnost, glukóza, bílkoviny, bilirubin, urobilinogen, krev, leukocyty, ketolátky, dusitany • Hematologie - počet leukocytů a jejich diferenciální rozpočet, počet erytrocytů, střední objem erytrocytu, hemoglobin, hematokrit, počet trombocytů + minimálně dva parametry hemokoagulace – např. PT, APTT, fibrinogen..) • Biochemie - močovina, glukóza, jaterní enzymy např. AST, ALT, ALP, bilirubin, chelesterol, bílkoviny, albumin, kreatinin, vápník, prvky P, Ca, ionty K, Cl, Na, aj.

6. Patologické vyšetření Patologická vyšetření: • odhaluje makroskopické změny na orgánech zvířat Biometrická vyšetření: • měření velikosti orgánů • (hmotnost orgánu/hmotnost těla) x 100 Histologiká vyšetření: • zjišťuje mikroskopické změny (změny na buněčné úrovni) na orgánech a tkáních s použitím mikroskopu.

7. Testování toxicity průmyslových chemikálií IV(reprodukční a vývojová toxicita) Průmyslová toxikologie (C867)

8. Důvody testování reprodukční a vývojové toxicity Thalidomid: • v 50. letech 20. st. byl ve 48 státech používán jako lék na nevolnost pro těhotné ženy. Narodilo se 12 000 postižených dětí bez nohou, rukou, uší, apod. Způsoboval především tzv. fokomelii, při které se nevyvine střední část paže, a tak prsty vyrůstají v podstatě přímo z ramene • vývojová toxicita

9. Důvody testování reprodukční a vývojové toxicity Agent Orange: • směs herbicidů, použita americkou armádou 1962 – 1972 v jižním Vietnamu s cílem zničit rostlinstvo v rozsáhlých oblastech tak, aby mohly být snáze bombardovány základny a zásobovací trasy nepřátelských jednotek; vedlejším produktem při výrobě jedné ze složek Agent Orange byl vysoce jedovatý dioxin – způsobuje vznik rakoviny + vrozené vývojové vady (tj. toxický účinek pesticidů na reprodukci). • vývojová toxicita

10. Reprodukční a vývojová toxicita Studie reprodukční a vývojové toxicity poskytují informace o možných toxických účincích testované látky na reprodukční schopnosti samce či samice či na vývoj potomstva, tj. na: • funkci pohlavních žláz samce či samice • průběh estrálního cyklu samice • chování při páření, březosti, porodu a laktaci • mortalitu, růst a vývoj potomstva. • Speciální reprodukční studie odhalují schopnost chemických látek vykazovat biologickou aktivitu shodnou nebo protikladnou s přirozenými hormony – endokrinní disruptory (xenoestrogeny a xenoandrogeny).

11. Fyziologie rozmnožování potkanů • pohlavní dospělost samic: 5 – 8 týdnů • pohlavní dospělost samců: 6 – 8 týdnů • zařazení do chovu: 9 – 12 týdnů • (dle metodiky: kmen Wistar – od 12 týdnů) • estrální cyklus samic: 4 – 5 denní • vlastní estrus (říje): 7 – 20 hodin • ovulace: za 2 – 3 hodiny po začátku estru • gravidita: 21 – 23 dnů • počet mláďat ve vrhu: 9 – 13 (někdy i 20) • počet vrhů za rok: 7 - 9 • odstav mláďat: ve věku 21 dnů

12. Typy studií Neexistuje studie nevyžadující použití zvířat • Reprodukční/vývojová toxicita – screening test – OECD 421 • většinou 1. krok v testování reprodukční toxicity - studie s menším počtem zvířat, kratší dobou expozice • negativní výsledek → nutno pokračovat v dalších studiích • Studie prenatální vývojové toxicity (teratogenita) - OECD 414 • Jednogenerační studie reprodukční toxicity - OECD 415 • Dvougenerační studie reprodukční toxicity - OECD 416

13. Typy studií • Kombinace studií dlouhodobé a reprodukční toxicity • 28-denní studie + Reprodukční Screening - OECD 422 • 90-denní studie + Jednogenerační studie - OECD 408 + 415 • Studie odhalující endokrinní disruptory • Uterotrofický screeningový test - OECD 440 • Hershberger screeningový test - OECD 441

14. Obecné podmínky reprodukčních studií Pokusná zvířata • doporučený druh dle metodiky: potkan (kmen, věk, hmotnost) • pohlavně dospělé samice, nullipary, pohlavně dospělí samci • aklimatizace minim. 5 dnů; počet dle metodiky Plán studie Podmínky chovu • teplota: 22 ± 3˚C; relativní vlhkost: 30 – 70%; • osvětlení: 12 hodin světlo/12 hodin tma • krmení a voda: ad libitum Výběr vehikula • přednostně voda (olivový olej, metylcelulóza...) • stanovení stability a homogenity látky ve vehikulu

15. Obecné podmínky reprodukčních studií Dávkové hladiny • minimálně 3 úrovně dávek a kontrola (vehikulum) – vycházejí z výsledků akutních a dlouhodobých studií toxicity, literatury a případně výsledků pilotního testu s omezeným počtem zvířat • limitní test – 1000 mg.kg-1 Aplikace • orální (sondou do žaludku), denně, ve stejnou dobu • objem 1 ml/100g živé hmotnosti (vodné roztoky až 2 ml/100 g živé hmotnosti) Vyšetření • kontrola zdravotního stavu: denně (před aplikací) • klinické vyšetření: minimálně 1x denně (po aplikaci) • tělesná hmotnost a spotřeba krmiva (intervaly dle metodiky) • patologické vyšetření

16. Průběh reprodukčních studií Generace • parentální generace – tj. rodičovská generace (P) • filiální generace – tj. potomstvo (F1, F2...) Aplikace testované látky – reprodukční toxicita • po určitou dobu před pářením (screening – 2 týdny, jednogenerační – 10 týdnů), po dobu páření, po dobu březosti a určitou dobu laktace (screening – do 4. dne, jednogenerační – do 21. dne) Aplikace testované látky – teratogenita • účinek prenatální expozice na březí samici a na vyvíjející se organismus v děloze → aplikace látky pouze po určitou dobu březosti – od 5. (tj. od implantace vajíčka v děloze) do 19. dne březosti Určení nultého dne březosti • dle zjištění spermií ve vaginálním výplachu - následující den po zahájení páření a poté denně až do zjištění spermií

17. Vyšetření mláďat po narození Klinické vyšetření mláďat • počet a pohlaví mláďat živě narozených • předčasně narozená a výrazně menší mláďata • viditelné anomálie • abnormální chování mláďat • Vzhled a vývoj mláďat po narození • Novorozená mláďata potkana kmene Wistar jsou holá, masově růžová, mají slepená oční víčka, zarostlé zvukovody, nemají prořezané zuby a váží asi 5 – 7g. Na čichové a dotykové podněty reagují hlasově (jemné pískání), kroutivými pohyby trupu a „pádlováním“ končetin. Pokud jsou dobře nakrmená, na břiše v krajině žaludku prosvítá přes tenkou břišní stěnu žaludek naplněný mlékem

18. Vyšetření mláďat po narození Poporodní vývoj mláděte – důležité etapy 2. – 3. den: odklopení ušních boltců, růstsrsti 4. den: otevírání zevních zvukovodů, 9 –12 g 8. – 10. den: prořezávání horních řezáků, srst na hřbetě 10. – 17. den: otevírání očí 12. – 14. den: přijímání pevné potravy, 25 – 35 g 18. den: první stoličky 21. den: druhé stoličky, 35 – 50 g

19. Vyšetření spermií Suspenze spermií • jedno nadvarle + 0,9% roztok NaCl Motilita spermií • Suspenze spermií se kápne na vyhřáté podložní sklíčko (cca 35 °C), vyšetření se provádí pod mikroskopem s předehřátým posuvným stolkem. Porovnává se rychlost pohybu spermií u kontrolních a aplikovaných zvířat. Morfologie spermií • Na podložní sklíčko se zhotoví nátěr suspenze spermií a na vzduchu se nechá zaschnout, po obarvení se vyšetří pod mikroskopem – stanovuje se procentuální zastoupení abnormálních spermií

20. Patologické vyšetření – reprodukční toxicita • makroskopická revize orgánů dutiny hrudní a břišní • hmotnost varlat, nadvarlat, prostaty, dělohy, vaječníků, hypofýzy • počet implantací na děloze • počet žlutých tělísek na vaječnících • odběr pohlavních orgánů k histologickému vyšetření: varlata, nadvarlata, semenné váčky, koagulační žláza, prostata, děloha, vaječníky, vejcovody (fixace: 4% formaldehyd, modifikovaná Davidsonova tekutina) • histologické vyšetření – pohlavní orgány a hypofýza + detailní vyšetření spermiogeneze ve varlatech (především u screeningu – kratší doba aplikace před pářením)

21. Patologické vyšetření – teratogenita Vyšetření plodu • zjištění pohlaví a hmotnosti jednotlivých plodů • vyšetření zevních odchylek plodů a změn kostry a měkkých tkání • důkladná pitva u poloviny plodů z každého vrhu  • fixace (96% etanol) druhé poloviny plodů z každého vrhu pro další zpracování a barvení k mikroskopickému vyšetření skeletu

22. Vyhodnocení výsledků • Primární údaje se zaznamenávají do tabulek a numerické výsledky se zpracují vhodnou statistickou metodou. Ukazatele toxicity samců a samic • počet zvířat na začátku studie, počet březích zvířat, počet potratů a předčasných vrhů, mortalita, doba nástupu abnormálních klinických příznaků, hmotnost zvířat a spotřeba krmiva, hmotnosti pohlavních orgánů, nálezy z pitvy, histologické vyšetření, NOAEL pro samce a samice, výpočet indexů reprodukce Ukazatele vývojové toxicity podle dávky • počet žlutých tělísek, počet implantací, počet živých mláďat či plodů, počet resorpcí, poměr pohlaví, tělesné hmotnosti mláďat či plodů, vývoj mláďat po narození, zevní změny měkkých tkání a kostry, preimplantační ztráty: implantace/žlutá tělíska, postimplantační ztráty: resorbované plody/implantace a postnatální ztráty (ztráty mláďat po narození) , NOAEL pro vývoj.

23. Endokrinní disruptory • exogenní látky nebo směsi látek, které mohou alterovat funkci endokrinního systému a následně poškozovat zdraví jedince, jeho potomstva či dalších generací, chemické látky s (anti)estrogenním, (anti)androgenním či (anti)thyroidním účinkem - široce používané chemikálie • expozice člověka a celého životního prostředí těmto látkám vysoká • pokles počtu spermií, nárůst rakoviny mléčné žlázy a pochvy u člověka Příklady • ftaláty (změkčovadla v PVC) • endosulfan (insekticid) • bisphenol A (fungicid, plastové obaly potravin, dětské umělohmotné lahve) • atrazin (široce používaný herbicid v zemědělství) • dioxiny (vznik při spalování odpadu s chlórem)

24. Endokrinní disruptory Uterotrofický screeningový test • použití pro testování estrogenového agonismu –xenoestrogenů, (méně běžné je použití pro testování estrogenového antagonismu) • Princip: aplikace testované látky pohlavně nedospělým nebo kastrovaným samicím → statisticky signifikantní zvýšení hmotnosti dělohy závislé na dávce ve srovnání s kontrolní skupinou = důkaz estrogenního agonismu • (růst děložní tkáně je pod vlivem estrogenů, pokud není k dispozici endogenní zdroj estrogenů, k růstu děložní tkáně může docházet vlivemestrogenů exogenních)

25. Endokrinní disruptory Hershberger screeningový test • použití pro testování androgenového agonismu –xenoandrogenů či androgenního antagonismu • Princip: aplikace testované látky kastrovaným samcům → statisticky signifikantní zvýšení hmotnosti přídatných pohlavních orgánů závislé na dávce ve srovnání s kontrolní skupinou = důkaz androgenního agonismu (např.: prostata, semenné váčky) • (růst některých tkání u samců je pod vlivem androgenů, pokud není k dispozici endogenní zdroj androgenů, k růstu těchto tkání může docházet vlivem androgenů exogenních)