1 / 11

מעבדה מס' 3

מעבדה מס' 3. R+L RL Kd=[R][L]/[RL]. קישור [ H 3 ] – קלונידין לרצפטורים α2 אדרנרגיים. מטרות: 1. קביעת Kd עבור קלונידין 2. קביעת ריכוז הרצפטורים ה- α2 אדרנרגיים בממברנה (Bmax). הגדרות: RL = B (bound) רצפטור וליגנד קשורים R + RL = Bmax מקסימום אתרי קישור לליגנד

dasan
Télécharger la présentation

מעבדה מס' 3

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. מעבדה מס' 3 R+L RL Kd=[R][L]/[RL] קישור [H3] – קלונידין לרצפטורים α2 אדרנרגיים מטרות: 1. קביעת Kd עבור קלונידין 2. קביעת ריכוז הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בממברנה (Bmax) • הגדרות: • RL = B (bound) רצפטור וליגנד קשורים • R + RL = Bmax מקסימום אתרי קישור לליגנד • = מס' הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בממברנות • L = F ליגנד חופשי (מזניחים את B לעומת F)

  2. שיטות להפרדת ליגנד חופשי מהקומפלקס • 1. צנטריפוגה • חיסרון: • ליגנד חופשי יכול לשקוע, ולכן ההפרדה קשה. • 2. דיאליזה בשיווי משקל • בשיווי משקל, ריכוז הליגנד החופשי יהיה זהה בתאים A ו-B. לכן, כמות הליגנד הקשור היא: • cpm B – cpm A = cpm (bound) • חיסרון: • - זמן רב עד הגעה לשיווי משקל • - יכולה להתרחש אינאקטיבציה או פירוק של הרצפטור • שיטה זו מתאימה גם לקבועי קישור קטנים (אפיניות נמוכה, Kdגבוה) • הליגנד עלול להיקשר לממברנה של הדיאליזה • 3. פילטרציה - פילטר מסיבי זכוכית • חיסרון: • ספיחה של ליגנדים הידרופוביים לסיבי הזכוכית. לכן, חייבים לשטוף וכתוצאה הקומפלקס עלול להתפרק (ולהסיט את שיווי המשקל). • לפיכך, מתאים ל-Kd של כ-5nM(Kd נמוך = אפיניות גבוהה בין הליגנד והרצפטור)

  3. שיטת הפילטרציה מותנית באפיניות הליגנד לרצפטור Kon R + L RL Koff יחידות: מאפיין ראקציה מסדר ראשון כי הוא תלוי רק בגורם אחד RL • 1 • Sec M*sec Kd = Koff = [R][L] Kon [RL] מאפיין ראקציה מסדר שני כי הוא תלוי בשני גורמים R + L חישוב זמן מחצית חיים של קומפלקס עם Kd בין 1-10nM: t1/2 = ln2 = ln2 = ln Koff Kd*Kon (10-9~10-8)M*108M-1*sec-1 t1/2 = 0.7 - 7 sec Kon מקסימלי הוא קבוע הדיפוזיה: מבטא את תנועת החלקיקים (במים לדוגמא). במצב של Kon מקסימלי כל התנגשות בין L ו R מביאה ליצירת קומפלקס RL Kon(max) = 108M-1 * sec-1 זהו ערך זמן מינימלי כיוון שחישבנו אותו על סמך קבוע הדיפוזיה (Konמקסימלי). מסקנה: השיטה מוגבלת לבחירת קומפלקס רצפטור-ליגנד מתאים (עם ערך Kd מספיק נמוך) המשמעות המעשית עבורנו: 1.פילטרציה מהירה (ע"י ואקום) 2. עבודה בקור, להקטנת Koff (הגדלת t1/2)

  4. S+N cpm (B) S N [clonidine] (F) N קישור לא ספציפי S קישור ספציפי S+N קישור כולל • קישור ספציפי לרצפטורים α2 אדרנרגיים • קישור לא ספציפי לחלבונים ושומנים ממברנליים, סיבי הפילטר ודפנות המבחנה • עקום הקישור הלא ספציפי הוא לינארי כי הוא תלוי רק ב-[L] • עקום הקישור הספציפי הוא עקום רוויה כי אתרי הקישור מוגבלים • הקישור הלא ספציפי נקבע ע"י הוספת NA קר בריכוז גבוה • מדוע נעשה שימוש ב-NA קר ולא בקלונידין קר? • ישנם בממברנה אתרי קישור ספציפיים לקלונידין, שאינם α2 אדרנרגיים ואנו מעוניינים להחשיב אתרים אלו כקישור לא ספציפי • NA שונה מבנית מקלונידין, ולכן NA יכיר את הרצפטורים ה-α2 אדרנרגיים בלבד ורק אותם הוא יחסום. כך נוכל למדוד את הקישור הלא ספציפי שנובע מאתרים ספציפיים לקלונידין ושאינם רצפטורים α2 אדרנרגיים • הפילטרים הספוגים בקלונידין מסומן משמשים למדידת total = B+F

  5. B רצפטורים קשורים Bmax*F B = Kd + F Vmax*[S] V = Km + [S] Bmax 50% Kd F ליגנד 1 = Kd * 1 + 1 B Bmax F Bmax (Bmax-B)*F Kd = B B = Bmax - B F Kd Kd שיטות לינאריזציה של עקומת הרוויה: כמו משוואת מיכאליס-מנטן: אפשר להפוך את משוואת העקומה למשוואה של קו לינארי, ע"י החלפת המונה במכנה ואז מקבלים את משוואת linweaver-burk אפשר גם לבודד את ה-Kd מנוסחת עקום הרוויה ולהפוך אותה למשוואה של קו לינארי, ואז מקבלים את משוואת scatchard

  6. 1/B (mg/fmol) 1/Bmax a = Kd/Bmax -1/Kd 1/F (1/nM) Linweaver-burk יתרון: רוב הנקודות מתרכזות ליד ציר ה-y (ריכוזי רוויה), נקודת החיתוך ברורה ולכן Bmax אמין חיסרון: הנקודות הרחוקות מציר ה-X (ריכוזים נמוכים) מפוזרות ומשפיעות על קביעת שיפוע הקו. לפיכך, Kd לא אמין

  7. B/F (fmol/mg*nM) B (fmol/mg) R+L RL Kd=[R][L]/[RL] B/F Kd = (Bmax – B)F B a = -1/Kd Bmax B = Bmax – B F Kd Kd Scatchard יתרון: הנקודות מפוזרות לאורך הגרף באופן אחיד ולכן קביעת Kdהינה אמינה חיסרון: בריכוזי רוויה, B לא משתנה אבל B/F הולך וקטן עם העלאת הריכוז. לכן, יש פיזור אנכי של נקודות בקרבת ציר ה-x וקשה להחליט היכן לחתוך את הציר. לפיכך, קביעת Bmax פחות אמינה

  8. הנחות עליהן מבוססים הפיתוחים: 1. יחס קישור RL הוא 1:1 ואין קואופרטיביות 2. ריכוז הליגנד גדול בהרבה מריכוז הרצפטור (לכן L=F) 3. הרצפטור יכול להיות במצב חופשי או בקומפלקס, ללא צורות ביניים 4. כל המדידות נעשות במצב של שווי משקל

  9. שיטות לזיהוי קרינה: • קרינת β= פליטת אלקטרון תוך כדי התפרקות • מונה גייגר: האלקטרונים המשתחררים נקלטים ע"י גז שעובר יינון ויוצר מתח חשמלי • חשיפה לפילם: האלקטרונים נקלטים ע"י יוני Ag+. אלו מתחזרים, שוקעים ויוצרים בנד שחור על הפילם • מונה סנטילציה: פלט מעבד: מתרגם את האותות החשמליים ל-cpm מדידה כפולה: רק התפרקות שנמדדה בו זמנית ע"י שני החיישנים תתורגם ל-cpm Photomultiplier: אנרגיית הפוטון הופכת לפוטנציאל חשמלי, תוך כדי הגברת הסיגנל דוגמא יש צורך להשתמש בנוזל סנטילציה, על מנת להגביר את הסיגנל (רק במקרים בהם קרינת ה-β נמוכה, כמו בטריטיום)

  10. יותר חומר רדיואקטיבי יותר התפרקויות (dpm) יותר אלקטרונים מעוררים פוטנציאל חשמלי גדול יותר יותר ספירות (cpm) dpm = disintegrations per minute cpm = counts per minute cpm/dpm = 0.5 = יעילות המונה Ci = מספר ההתפרקויות של גרם רדיום = 2.2*1012dpm דקה Specific radioactivity = Ci = כמות חומר חם mmole סה"כ חומר אם כך:

  11. איזוטופים רדיואקטיביים הנמצאים בשימוש בביולוגיה:

More Related