第六章组合化学

第六章组合化学 Combinatorial chemistry • 组合化学是一项新型化学技术，他利用一系列合成、测试技术，在短时间内合成数目庞大的有机化合物，经过高效生物活性筛选，从中发现一批具有活性的药物前体。 • 组合化学是应生物学家建立起来的高通量筛选技术的需要而产生的。 • 组合化学合成技术已经给传统的有机合成化学带来了革命性的变化，是近年来科学上取得的重要成就之一。

组合化学的起源 • 组合化学最早起源于固相多肽合成。就本质而言，组合化学是建立在高效平行的合成之上的，这种合成方法步骤有限，但生成的化合物库内包含大量化合物。 • 组合化学不是单一的一种技术，它包含了一系列化学技术。它是一门交叉性学科，它以有机化学为基础，与生物化学、药物化学密不可分，并涉及到数学、物理和计算机等多门科学。而传统有机合成方法是对单个分子分步合成，在数量上是处于低层次的，合成速度太慢，无法满足对化合物量的需要。

第一节，组合化学概念 • 以组合化学为基础的策略极为简单，即化学组块的组合，可存在着多种组合排列。 • 因此化学家不在去寻找把化合物A和B转化为C的条件，而是发现一系列As和Bs转化成大量Cs的最佳条件。

五肽的合成 • 用20种天然氨基酸合成的五肽，组合起来有以下种： • 二聚体 202=400 • 三聚体 203=8000 • 四聚体 204=160,000 • 五聚体 205=3200,000

一、组合化学策略 • 要合成大量的化合物，目前有两种不同的策略可以进行： • 混合物合成方式和平行合成方式

混合物合成方式 • 既是在反应体系中多种反应物混合在一起进行反应，得到多种产物如：正丁酸与醇缩合形成酯的反应。

平行合成方式 • 是指在合成过程中以平行的方式同时合成多种反应产物。 • 每个反应是独立进行的，如上述反应当每个反应同时独立进行时，即为平行合成方式。

高通量筛选 High Throughput Screening • 指在药物筛选过程中的一种新方法

分子多样性 Molecular diversity • 是一种描述分子并把它们分成若干个有用组的技术（计算机设计技术）。 • 可以通过对所设计合成的化合物库中各个分子的物理化学性质等多方面的计算而分成不同特性的组，以利于高通量合成和筛选。 • 如亲水性，疏水性，键长等等。

高通量合成 High Throughput Synthesis • 一种大量合成化合物的方法。

二，固相合成法 • 是最早以固相肽合成建立起来的组合方法。 • 固相合成Solid phase synthesis技术由Merrifield(1963)首创，他使用取代的树脂作为固相载体来合成多肽； • 但是大量的以多肽合成方法衍生出来的固相合成策略的应用是在80年代才有了突破。

固相合成的优点 • 1）可以使用过量的试剂是反应趋于完全。 • 2）反应结束后，可以通过过滤、洗涤固相介质除去反应物。 • 3）节省了分离纯化的时间 • 4) 反应收率高，产物纯度高。

树脂珠的种类 • 目前固相合成中较多使用的树脂是小的球状树脂珠（80-200um）,常用的有以下几种

1,交联聚苯乙烯 • 结构

活化方式 • 1)氯甲基化 • 2)氨基化 • 3)羧基化

2，聚酰胺树脂 • 由于聚苯乙烯树脂与所合成的极性化合物（多肽，寡核苷酸等）在溶剂中的溶解性不相同，不利于它们的合成，因此Shepparl设计了聚酰胺树脂；它们是以N,N’-双烯丙酰基乙二胺为交联剂，以N,N’-甲基丙烯酰胺为骨架的聚合物。

3，多孔玻璃 • 聚苯乙烯和聚酰胺树脂通常缺乏结构上的刚性，不能用于需要长期溶剂化而达到连续流动合成的目的。 • 因此人们又设计了许多新型大孔高聚物，其中较好的是多孔玻璃，它是一种刚性的衍生化的玻璃球状物，可以与任何溶剂相容，对腐蚀性溶剂和高压、高温都比较稳定。

合成方法 • 茶叶包法 tea-bag • 用具有74mm网眼的聚丙烯网袋（15mmX20mm），里面装满树脂珠，密封好。最初树脂珠上都连有一个保护的氨基酸，然后它被浸在反应物核偶联剂的混合溶剂中，把袋子集中进行脱保护、洗涤、中和及再偶联等步骤。

混合均分法Mix-Split • 一珠一物法(one bead,one compound)， • 该方法依赖于在树脂珠上合成化合物，一定数量的载体被分成相等的几部分，然后各部分独自与不同的起始单体原料反应。 • 反应后，树脂的各部分又重新合并，混匀，再被分成几部分，进一步与一系列试剂反应。

图例

其他固相合成方法 • 多针上的合成在40mm, 直径为4mm的聚苯乙烯针上合成。 • 在园片上合成在直径0.635cm，厚度为0.3715cm的聚苯乙烯上合成。 • 在薄片上合成在玻璃片、纸片上合成（50-400um）.

三、液相合成法 Solution phase Synthesis • 由于应用固相合成的化学反应范围有限，而且当反应物和产物连接到固相载体上时，检测反应过程比较困难，因此人们重新研究了液相合成方法。

平行液相合成 • 通常平行液相合成包括一步或二步可靠的液相合成反应，如还原氨化反应、酰化反应等，可以以相对较小的量进行（10umol/L）。反应混合物可以用薄层层析和质谱分析，测定产物的浓度。

索引化合物库合成 • 化合物库通过选取每一个酰氯（A）,将其与等摩尔的亲核试剂混合物（N1-40），在二氯甲烷溶液中反应。 • 同样，在选取一个亲核试剂（N）与含所有酰氯的混合物(A1-40)反应。可以得到1600个化合物，从而构成了一个索引化合物库。

四、液体相合成 Liquid phase Synthesis • 由于液相合成存在一些不确定性，在合成的每一步之后均需进行某种形式的纯化，如果用平行合成大量的化合物，进行纯化的工作是相当烦琐的，如果用混合物方式合成，那么，纯化过程几乎是不可能的。 • 因此人们将传统的液相合成的优点与固相合成的优点结合起来，从而形成了液体相合成方法。 • 其原理是将化合物结合到一种可溶性高分子上，反应后，经过调节反应体系的溶剂、离子强度、pH等使高分子从溶液中沉淀下来。 • 目前使用的有聚乙烯醇单甲醚，它可以溶解在多种溶剂中，但在乙醚中可以结晶析出。

树枝状载体的组合合成 • 树枝状分子是分枝状寡聚物，一般为可溶性聚合物。利用该方法如同液体合成技术，寡聚物可以通过色谱技术分离纯化。合适的树枝状分子具有特殊的溶解性、化学稳定性和高载量。

树枝状载体的组合合成

五、组合合成的应用 • 药物合成与筛选 • 催化剂的合成与筛选 • 高分子试剂的合成与筛选 • 酶抑制剂的合成与筛选 • 酶催化的组合合成

第二节多肽的化学合成 • 多肽的化学合成，是按照设计的氨基酸顺序，通过定向形成酰胺键方法得到目标多肽分子 • 要成功的合成具有特定氨基酸顺序的多肽，必须采用定向形成酰胺键方法，即对暂时不参予形成酰胺键的氨基和羧基，以及侧链活性基团进行保护。同时还要对羧基进行活化。

一氨基的保护方法 • （1）叔丁氧基酰基（t-Boc） • t-Boc是常用的氨基保护基。二叔丁基二碳酸酯与氨基酸作用，形成t-Boc-氨基酸，可以有效地保护氨基。 • t-Boc基可以在温和的酸性条件下，以气态形式被除去。

（2）苄氧酰基（CBz） • CBz也是一种常用的氨基保护基。 • CBz在弱酸性条件下比较稳定，但在催化氢解条件下容易被除去。产物也容易分离。

二、羧基的保护方法 • （1）苯甲醇酯法 • 由苯甲醇与亚硫酰氯作用生成氯亚硫酸酯，然后再与氨基酸反应： • 此保护基可以用氢解方法除去。

（2）叔丁醇酯法 • 一般采用酯交换法得到氨基酸叔丁醇酯：叔丁醇基常用三氟甲酸水解方法除去。

三，肽键形成方法 1．羧基活化法 • （1）酰氯法 • 氨基酸的羧基可以通过以下的反应，方便地转变成酰氯： • 氨基酸的酰氯很容易与氨基作用形成肽键。但是，由于在反应过程中容易引起氨基酸的消旋化，实际应用价值不大。

（2）酸酐法 • 氨基酸的羧基可以转变成酸酐： • 这种酸酐有两个亲电中心，在形成肽键时能够产生几乎等量的副产物。

（3）活性酯法 • 常用的活性酯是氨基酸-对硝基苯酚酯。这种活性酯容易与氨基作用形成肽键。

2．偶联剂缩合法 • 偶联剂本身是一种脱水剂，它能够促进羧基和氨基之间的缩合反应。最常用的偶联剂是N,N’-二环己基碳二亚胺（简称DCC）。 • DCC先与一分子氨基酸的羧基反应，生成类似酸酐的中间产物。这种不稳定的中间物能够进一步与第二分子氨基酸的氨基作用，形成肽键。反应中产生的DCU不溶于大多数有机溶剂，容易与产物分离。 • 此法的优点是消旋化可能性很小。DCC是多肽合成中应用最广的一种试剂。

四. 多肽的固相合成 • 此法的基本过程是：将目标多肽的C-端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用（用DCC作偶联剂）形成肽键。不断重复这一过程，即可以得到目标多肽产物。 • 合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，即得到目标产物。

组成合成法合成多肽 • 在混合均分合成法中，每一个合成步骤分别合成出x组中间体，将这些中间体混合均匀后平均分成x份，并分别延长一个结构单元。 • 反应产物再混合均分成x份，再延长一个结构单元，直至完成全部合成。

第三节、多聚核苷酸的化学合成 • DNA 和 RNA 的化学合成非常复杂。与合成多肽类似, 必须按照一定的次序把核苷酸单元组合成具有特定碱基顺序的核酸。 • 由于核苷酸单元是多官能团分子，必须对参加反应的基团要进行活化处理，还要对不参加反应的基团进行保护，而且对保护、偶联和脱保护基的每一步反应要求具有高的产率。

一、保护基 • 多聚核苷酸合成过程中，需要保护的基团包括：碱基中游离的氨基, 戊糖的羟基(2'-,3'-或5'-羟基), 以及核苷酸的磷酸基。

1．碱基中游离氨基的保护 • 腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶中含有游离的氨基。在形成磷酸二酯键反应中可能生成不需要的磷酰胺, 必须进行保护。 • 常用于氨基保护的酰基有：乙酰基、异丁酰基、异丁氧羰基、苯甲酰基和对甲氧基-苯甲酰基等。 • 酰基保护基通常用浓氨水、NaOH或肼溶液水解除去。

2．戊糖羟基的保护 • 脱氧核糖上有两个羟基 (3‘-和5’-羟基), 而核糖则有三个羟基 (2‘-, 3’-和5‘-羟基)。在多聚核苷酸合成过程中, 对戊糖羟基进行选择性保护显得特别重要。 • 单对甲氧基-三苯甲基（MMT）、双对甲氧基-三苯基(DMT)或三苯甲基常用来选择性地保护5' - OH。 • 用四氢吡喃基（THP）保护醇羟基是一个在有机合成中广泛应用的方法。该保护基的引入和除去均在酸性条件下进行。 • 核糖2'-和3'-羟基处于顺式位置, 可以用异丙叉基同时进行保护。常用的保护剂是丙酮。

3．磷酸酯基的保护 • 甲基是常用的磷酸羟基保护基。甲醇与亚磷酰氯作用，生成单甲基亚磷酰氯。然后依次与含有游离3’-OH的核苷和二异丙基胺反应，得到一个质子化的活性中间体核苷3’- 亚磷酰胺。 • 上述反应是DNA固相合成的基本反应。 • 其它一些基团，如2, 2, 2－三氯乙基，芳基和 -氰乙基等也可用于磷酸酯基的保护。

二、磷酸二酯键的形成 • 主要有两种方法：将磷酸酯基转变成活性较高的磷酰氯; 二是加入偶联剂, 如DCC等。 • 一般来说, 核苷中的 5'-OH比较活泼(第一醇羟基), 比较容易磷酰化。所以通常是通过3’-磷酸核苷的 3'-P-OH和另一核苷的5'-OH之间形成磷酸二酯键。

三、DNA 的固相合成法 • DNA 固相合成法的基本原理与多肽固相合成法相似。先将目标 DNA 链 3'-端核苷上的 3'-OH 与树脂(固相)共价相连，然后将经过活化的单体核苷酸(不参加反应基团必须保护), 按设计的顺序依次加上去。 • 合成所用的活性单体是质子化的核苷 3'-亚磷酰氨。

第六章 组合化学