Estratégias para purificação de uma proteína

1. BIO10-329 Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Estratégias para purificação de uma proteína Os assuntos abordados nessa aula são: Métodos de centrifugação e precipitação diferencial Dosagem de proteínas Métodos cromatográficos Análise de eficiência da purificação Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

2. Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total H2O 1 70 Proteínas 3.000 15 Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7 Carbohidratos 50 3 Lipídeos 40 2 Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500 Principais componentes moleculares da bactéria E. coli A tabela acima mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em uma célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas. Como são as proteínas que executam a maior parte das funções vitais de um organismo, uma grande parte das questões na Biologia envolve conhecer em detalhes a estrutura 3D e o funcionamento de uma proteína. Para se obter uma proteína em particular, é necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica.

3. 1 proteína isolada Métodos de purificação Proteínas de uma célula Métodos de Isolamento de Biomoléculas O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D e a compreensão de suas propriedades biológicas. Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

4. Métodos de Isolamento de Biomoléculas Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas. Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis. Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias: Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas: 1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifugação, diálise, gel-filtração) 2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese) 3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa) Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas moléculas: 4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)

5. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total O fluxograma ao lado representa a “marcha” de purificação de uma proteína, mostrando as etapas sucessivas, cada uma consistindo de método, que levam ao isolamento de uma proteína presente numa mistura complexa. Observe a quantidade de proteínas (100g) presente no material inicial e quanto da proteína purificada se obtém no final (0,001g). Esses números são típicos para a purificação da maioria das proteínas, em especial enzimas. Em cada etapa, a proteína de interesse é separada das demais com base em uma propriedade diferente. Consequente-mente, as proteínas ainda misturadas com aquela que está sendo isolada são cada vez mais semelhantes em suas características físico-químicas, exigindo métodos cada mais sensíveis, capazes de explorar pequenas diferenças, para se chegar à proteína pura.

6. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total Além dos métodos de purificação, análises complementares devem ser feitas ao longo da purificação, para verificar se o processo de separação está sendo eficiente. A medida da atividade biológica da proteína de interesse e do conteúdo de proteínas de cada fração resultante do processo de separação devem ser feitas a cada passo. Assim, apenas a fração que contém a proteína de interesse, marcada com um círculo vermelho no fluxograma, é submetida à próxima etapa de purificação. • Medida da atividade biológica • - particular para cada proteína • - deve ser quantitativa, para estimar quanto da proteína de interesse há em cada fração. • Medidas do conteúdo proteico (diversos) • - absorbância de luz UV de 280 nm • - métodos colorimétricos • (ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)

7. Absortividade molar, e Comprimento de onda Métodos para medida do conteúdo de proteína: O gráfico mostra o espectro de absorção de luz UV dos aminoácidos aromáticos Trp, Tyr ou Phe. A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos na sua composição, especialmente triptofano. A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.

8. Métodos para medida do conteúdo de proteína: Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+ em tartarato Cu2+ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm 1. Cu2+ é quelado pela proteína [Cu2+-proteina] 2. Reação redox Cu2+ + (ligações peptídicas) —> [Cu+-proteína] Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-250 • Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. • Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina. Método de Lowry Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul. BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline Ìons Cu2+ reduzidos a Cu+ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,

9. com detergente por ultra-som Material na fonte células Homogeneização (para romper tecidos e células) tecidos Homogenado ou Extrato bruto Material de partida por pressão (prensa francesa) liquefação (Potter) Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc). Vários métodos são possíveis para transformar células, órgãos, tecidos em um homogenado, ou extrato bruto, como mostra a figura.

10. detergente micelas Dependendo da concentração Detergentes iônicos Detergentes não iônicos Proteínas integrais da membrana Complexos não micelares Triton X-100 (polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol) Cetab Cetyltrimethylammonium bromide SDS Dodecil sulfato de sódio Octilglicosídeo (octyl-b-D-glucopyranoside) Deoxicolato de sódio Sendo a proteína de interesse uma proteína de membrana, é necessário solubilizá-la. Para esse fim são utilizados detergentes, que dissolvem a membrana plasmática e formam complexos solúveis com as proteínas. Detergentes podem ser iônicos e não iônicos

11. A centrífuga Amostra sedimentando Câmara blindada rotor ângulo fixo centrifugação diferencial refrigeração vácuo homogenado células intactas pedaços de membrana núcleos mitocôndrias lisossomos ribossomos fração citoplasmática A centrifugação frequentemente é uma das primeiras etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme a técnica. Através de sucessivas etapas de centrifugação com velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-se obter diferentes frações de um homogenado de células ou tecidos. sangue centrifugado: separação de plasma e células

12. Força centrífuga Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações, dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar. Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g) Centrífuga Clínica Ultracentrífuga (necessitam vácuo para evitar atrito do ar, além de refrigeração) 1,200g por 15 minutos separa plasma de células sanguíneas 200,000 g por 24 horas para separar organelas menores ou complexos proteicos R$ 3.000 US$ 70,000 Preço aproximado

13. Solucões de sacarose com densidades diferentes são colocadas no tubo, uma sobre a outra Amostra é colocada no topo do gradiente 5% sacarose 20% sacarose Baixa densidade Média densidade Alta densidade centrifugação Gradiente separação de: Ficoll-Hypaque leucócitos Sacarose mitocôndrias Cloreto de césio ácidos nucléicos A centrifugação em um meio com gradiente de densidade melhora a eficiência da separação. As partículas se deslocarão através do gradiente até encontrarem uma região com densidade equivalente a sua, quando param de se mover, formando “bandas”. Gradientes podem ser utilizados para separar diferentes tipos de células, organelas, ácidos nucléicos, complexos proteicos, etc. Centrifugação em gradiente de densidade

14. NaCl KCl O gráfico ao lado ilustra o efeito de diferentes sais sobre a solubilidade da hemoglobina. Em baixa concentração salina, a solubilidade das proteínas aumenta, pois os íons do sal ajudam a reforçar a camada de solvatação. Em alta concentração salina, a solubilidade das proteínas diminue pois os íons do sal competem pelas moléculas de água disponíveis para formar a sua própria camada de solvatação. Sais com ânions divalentes são mais eficientes do que os monovalentes na precipitação de proteínas. MgSO4 Solubilidade da hemoglobina (S/S’) (NH4)2SO4 Salting-in X Salting-out K2SO4 Concentração do Sal,, Molar As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas. Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas. A precipitação de proteínas pode ser induzida por: - adição de sais (Precipitação salina) - adição de solventes - variação de pH (Precipitação isoelétrica)

15. Hemoglobina Albumina Mioglobina Proteínas apresentam diferente sensibilidade para a precipitação salina. Solubilidade, log - precipitam primeiro: proteínas maiores proteínas mais hidrofóbicas possuem camadas de solvatação maiores ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar. Pseudoglobulina Fibrinogênio Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar Sais se dissociam em solução aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação. Considere uma solução com fibrinogênio, albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e mioglobina e observe o gráfico. Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4, pode-se purificar completamente o fibrinogênio a partir de uma mistura das 5 proteínas, pois este precipita totalmente em uma saturação de 2,8 M do sal. Neste ponto, centrifuga-se a solução e o fibrinogênio é coletado como um precipitado. Numa próxima etapa, adicionando-se mais sal à solução até uma saturação de 7 M, pode-se obter um novo precipitado contendo albumina, hemoglobina e pseudoglobulina. E teremos também purificada a mioglobina, ainda em solúvel na presença de 7M do sal, e que ficou sozinha no sobrenadante.

16. Constante Dielétrica Momento Dipolar Solvente Proteína P.I. Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI tendem a precipitar, pois tendo carga neutra, apresentam a camada de solvatação menos organizada. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 Água Dimetilformamida Metanol Etanol Acetona Clorofórmio Benzeno 78.5 1.85 48.9 3.96 32.6 1.66 24.3 1.68 20.7 2.72 4.8 1.15 2.3 0.00 Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico. Solventes miscíveis com a água diminuem a constante dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação das proteínas. Os mais utilizados são etanol e acetona. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

17. Aos precipitados obtidos com sal ou solvente, adiciona-se água. Ao precipitado obtido com variação de pH, retornar ao pH original. Membrana de celofane solvente solução a ser dialisada Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é necessário reverter as condições que levaram à precipitação. final início Dt • Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise. • amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros • tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d. • - o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja • - excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente • - após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.

18. MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Lisossomos Lisossomos Mitocôndria Mitocôndria SOBRENADANTE ORGANELAS Golgi Golgi Núcleo Núcleo Precipitação com Sal/Solvente F F F F 1 2 3 4 Precipitação com Sal/Solvente F F F 2 .2 2 .1 2 .3 Cromatografia Troca Iônica . . . . . . F F F 2 .3.2 2 .3.1 2. 3.N Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente) F 2 .3.N.X Gel Filtração 1 Proteína apenas (0.001g) - 0.1 a 0.5% total Até o momento, exploramos as etapas iniciais de purificação de proteínas, como a centrifugação diferencial e precipitação fracionada. Esses métodos, apesar de terem baixo poder de resolução (exploram diferenças grosseiras entre as proteínas), permitem processar grandes volumes ou massas, típicos das etapas iniciais de isolamento. Quando já houve redução significa-tiva dos montantes de proteínas a serem processados, iniciam-se as cromatografias, que irão explorar as diferenças mais sutis entre as moléculas. Não esquecer que todas as frações obtidas devem ter o conteúdo de proteínas e de atividade biológica medidos, para se decidir qual/quais deverão passar para o passo seguinte da purificação.

19. Tempo zero Tempo 2 Tempo n Tempo 1 Amostra com diferentes componentes Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina Resina embebida em tampão Coletor de frações Concentração Tempo ou volume Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão), banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas. Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia: • Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como: • massa molecular • carga elétrica • solubilidade • afinidade Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.

20. Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração: • separação de moléculas pela massa molecular • géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros • Cromatografia de troca iônica: • separação de moléculas pela carga elétrica • géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente • Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica): • separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso • géis possuem carácter hidrofóbico • Cromatografia de afinidade: • separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante géis possuem ligante específico ligado covalente à resina Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?

21. proteína grande proteína pequena Tampão “empurra” moléculas através da resina grão da resina poroso tubos Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular Moléculas com massas diferentes Fluxo do tampão grãos (beads) da resina com poros Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída. Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de volume morto (Vo). Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).

22. traçado da medida de atividade biológica nas frações 25 50 75 100 125 mL volume de eluição A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de uma proteína em seu estado nativo Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo. Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular. Curva de calibração Observar a escala log Moléculas maiores Moléculas menores Massa molecular (kD) Absorbância a 280 nm Medida da ativ. biológica Ler a massa correspondente 20 40 60 80 100 120 mL Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao. volume Kav

23. indica quais os tamanhos das partículas que podem entrar nos poros da resina e serem fracionados. Acima ou abaixo da faixa, não há separação. Resinas para Gel-Filtração TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO NOME (kD) Sephadex G - 10 Dextrana 0.05 - 0.70 Sephadex G - 25 Dextrana 1 - 5 Sephadex G - 50 Dextrana 1 - 30 Sephadex G - 100 Dextrana 4 - 150 Sephadex G - 200 Dextrana 5 - 600 Bio - Gel P - 2 Policrilamida 0.1 - 1.8 Bio - Gel P - 6 Policrilamida 1 - 6 Bio - Gel P - 10 Policrilamida 1.5 - 20 Bio - Gel P - 30 Policrilamida 2.4 - 40 Bio - Gel P - 100 Policrilamida 5 - 100 Bio - Gel P - 300 Policrilamida 60 - 400 Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000 Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000 Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000 *Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio - Rad Laboratories Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo de moléculas ou partículas a serem separadas Moléculas pequenas Proteínas Moléculas pequenas Proteínas Células, partículas sub-celulares

24. Kav = Ve-Vo Vt-Vo Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de gel-filtração. O gel nessa coluna é o Sephadex G-200, cuja faixa de resolução de proteínas é de 5.000 a 600.000 d. Observe como proteínas nos extremos da faixa de resolução tendem a “sair” da parte linear da curva. Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr. Ve – volume de eluição de uma certa proteína Vt – volume total da coluna Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com massa acima da resolução da resina onde:

25. CM DEAE Trocadora de ânions Trocadora de cátions Cromatografia de troca iônica A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou negativa, em uma ampla faixa de pH. Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva), como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

26. - - - - - - - Cromatografia de troca iônica O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de 10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.

27. + + + + + + + + + + + + + + + + + + + Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica Adsorção No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou trocadora de ânions, como o DEAE-celulose): • A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas: • adsorção das proteínas com carga contrária à resina, e saída da coluna das proteínas com a mesma carga; • eluição das proteínas adsorvidas. Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna Eluição Para a eluição, as condições de adsorção da coluna (pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a interação entre as proteínas e a resina. Mais frequentemente utiliza-se um aumento da concentração do sal no tampão, pois alterações de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar dentro da coluna. Na+Cl- + Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.

28. Proteína P.I. Pepsina <1,0 Ovalbumina galinha 4,6 Albumina sérica humana 4,9 Tropomiosina 5,1 Insulina bovina 5,4 Fibrinogênio humano 5,8 Gama-globulina 6,6 Colágeno 6,6 Mioglobina equina 7,0 Hemoglobina humana 7,1 Ribonuclease A bovina 7,8 Citocromo C equino 10,6 Histona bovina 10,8 Lisozima, galinha 11,0 Salmina, salmão 12,1 PI ácido básico + - neutro H + - -COOH -COO + -NH2 -NH3 H + Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica. Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio. Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos. Responda: em pH 7,0, qual será a carga elétrica da albumina, da mioglobina e do citocromo C ?

29. + Eluição NaCl Eluição NaCl _ + + 0. 10 M (+) 0. 10 M (-) + + + = 0. 15 M 0. 15 M DEAE (+) CM (-) _ (-) 0. 20 M _ 0. 20 M = (+) = (-) = (+) _ Não retidas Não retidas + + + + + Duas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do tampão de eluição. As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas, sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina). Carboximetil~celulose (trocadora de cátions) Dietilaminoetil~celulose (trocadora de ânions)

30. NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH N+(CH ) Troca aniônica 2 3 3 resina de polistireno Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO -H Troca Catiônica 3 resina de polistireno DEAE - celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas - CH CH N+(C H ) ácidas e neutras 2 2 2 5 2 CM - celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas - CH COOH básicas e neutras 2 DEAE - Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH CH N+(C H ) e troca iônica de proteínas 2 2 2 5 2 ácidas e neutras CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração ácido - CH COOH e troca iônica de proteínas 2 básicas e neutras * Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio - Gel: Bio Rad Laboratories Tipos de Resina de troca Iônica Tipos de Resina de troca Iônica Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

31. Adsorção Mistura de proteínas Eluição Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A Lavagem pH 2,0 ou sal Complexo Ag-AC é desfeito Anti-A interage apenas com a proteína A Coluna empacotada com esse gel Desprezar proteínas não retidas Antígeno A puro - Cromatografia de afinidade: Ex: cromatografia de imunoafinidade Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas. A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas, hidrofóbica, pontes de H) ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto). Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou por competição com o ligante livre

32. Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade 1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo - análogos de substratos ou inibidores de enzimas - agonistas ou antagonistas de receptores - haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos - ligantes com “tag” ou “marcação” - glutationa-S-transferase - poli-Histidina 2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos: 8-AEA-cAMP 8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic monophosphate (ligante para proteínas com afinidade por cAMP ou cGMP) Sítios de ligação das proteínas A, G e L à imunoglobulina, que permitem a purificação de anticorpos por cromatografia de afinidade

33. Braço espaçador covalente entre a resina e o ligante Molécula-alvo (analito) ligante Ligação reversível não covalente Estratégias para acoplamento deligantes à resina ReagenteAlvo no ligante Preparo da resina de afinidade: Passo 1. Ativação da resina Passo 2. Acoplar o ligante Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade ou impede sua ligação à resina. A introdução de um braço espaçador (alguns C) diminue o risco.

34. AMOSTRAS Fase móvel (líquido ou gás) Fase estacionária (suporte sólido) X Duas Possibilidades - Amostra se deslocará (é mais solúvel) acompanhando a Fase Móvel - Amostra nãose deslocará (é mais solúvel) na Fase Estacionária CROMATOGRAFIA DE PARTIÇÃO CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA Suporte: PAPEL Suporte: GEL DE SÍLICA (camada delgada ou TLC) Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose) Fase Estacionária: sílica (mineral apolar) Fase Móvel: Solvente orgânico(hidrofóbico) Fase Móvel: Solvente aquoso ou água Cromatografia de Partição Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade diferentes, um polar e outro apolar. Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos, açúcares, lipídeos, etc. Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença de solvente orgânico. Consiste de 2 sistemas: Dois tipos de montagem:

35. distância de migração da substância distância de migração do solvente R = f Cromatografia de Partição tempo 0 t 1 t2 tn Papel ou placa de sílica direção do fluxo do solvente Amostra na origem Compostos separados Cuba com solvente (fluxo por capilaridade) Para um dado sistema de solvente e tipo de suporte, cada substância apresenta um valor de Rf característico. Assim, além de um método de purificação, as cromatografias de partição permitem identificar e quantificar (pela intensidade das manchas obtidas após a separação) diferentes compostos. Pode-se ainda recortar a mancha de interesse do papel ou da sílica e recuperar o composto isolado.

36. Detector Controle e análise dos dados Coletor de frações Coluna e forno bombas Injetor de amostra HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography • Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias. • Característica diferencial da cromatografia convencional: • partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns) • aumento da eficiência da separação em função do número maior de grãos de resina em um mesmo volume da coluna • fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna Desenho básico de um HPLC Duas bombas permitem eluição em gradiente Detector: índice de refração, absorbância UV ou Vis, fluorescência, etc. Coluna pode ser aquecida para melhorar a eluição diferencial na fase reversa

37. CN Fenil NH2 C4 C8 C18 Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia Moléculas não retidas Moléculas retidas 100 Fase estacionária Função C18 –Si (CH3)2C18 H37 C8 –Si (CH3)2C8 H17 tC2 –Si C2 H5 Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2 Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH Absorbância a 214 nm % de acetonitrila Tempo ou volume de retenção Fase reversa:resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila Condição de equilíbrio: em meio ácido (0.1% de ácido trifluoroacético) para aumentar hidrofobicidade (protonar as carboxilas) Eluição com gradiente crescente de solvente orgânico miscível com água - acetonitrila, metanol, propanol

38. matriz hidrofóbica H Proteína altamente hidrofílica P Proteína menos hidrofílica P camada de H2O solvatação [sal] [Proteína] volume Cromatografia de interação hidrofóbica É um processo de partição que explora a interação entre aminoácidos apolares de uma proteína e uma matriz de carácter hidrofóbico. Proteínas em solução salina concentrada “perdem” parte da camada de solvatação para os sais, expondo na superfície regiões ricas em aminoácidos apolares, que interagem com uma matriz hidrofóbica Três estratégias para eluição: 1. diminuir a concentração de sal 2. diminuir a polaridade da fase móvel 3. adicionar detergente Força da interação hidrofóbica aumenta com o tamanho da cadeia de C na resina: Fenil (C6-OH) > Butil (C4) > Octil (C8) Eficiência dos sais em provocar “salting-out” varia com a série de Hofmeister: Ânions: PO4-2> SO4-3>CH3COO->Cl->Br->NO3->ClO4->I->SCN- Cátions:NH4+>Rb+>K+>Na+>Cs+>Li+>Mg+>Ca+>Ba+

39. Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? • Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína: • Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida • através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes • em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação. • Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína • de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades • específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura). • Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de • partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces- sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas • que apresentam pouca atividade). • Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes • etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de interesse.

40. Purificação da Glicoquinase hepática de Rato Etapa Rendimento Etapa Atividade Específica Atividade Específica b c b Índice Índice b b ( U.mg-1) ( % ) ( % ) ( U . a . - Purificação Purificação Marcha A: somente cromatografias convencionais 1. Sobrenadante de pâncreas 0.17 100 1 2. (NH4) SO4, precipitado 25 -55% 85 12 2.0 2 3. troca iônica, coluna DEAE -Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 23 45 140 4. troca iônica, coluna CM - cellulose , pH 5.5, eluição NaCl 44 33 260 6. interação hidrofóbica, coluna Butyl~Sepharose 80 15 480 7. gel - filtração, coluna Sephacryl S -300 130 15 780 Marcha B: com cromatografia de afinidade 1. Sobrenadante de pâncreas 0.09 100 1 2. troca iônica, coluna DEAE - Sephadex , pH 7.0, eluição KCl 18 84 195 a U nidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza 3. Afinidade cromatográfica ( benzamidina~agarose ) 420 83 4.500 a transformação de1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas Atividade específica : medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína b c Rendimento : percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação d Índice de Purificação :razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa. Uma tabela como a vista acima é a maneira usual de se descrever o resultado de uma purificação. No exemplo acima, a mesma proteína foi isolada por duas “marchas” diferentes de purificação (A e B). Observe os parâmetros de purificação. Se você fosse repetir essa purificação, qual esquema de purificação escolheria ? EU TERIA ESCOLHIDO A MARCHA B.

41. + acrilamida N,N´-metilenobisacrilamida Catalisador (persulfato de amônio) poliacrilamida Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ? A eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) permite visualizar a composição de proteínas de uma amostra. É um método complementar para a purificação de proteínas. Fornece informações sobre a massa molecular e composição de subunidades da proteína em meio desnaturante e redutor. A poliacrilamida é um polímero que um gel de malha porosa. A poliacrilamida funciona como uma peneira, deixando passar através de seus poros as moléculas pequenas e retendo as grandes • É formado a partir da reação de acrilamida e bisacrilamida. • concentração de acrilamida variando de 5 a 20% determina o diâmetro dos poros • uso de gradiente de acrilamida aumenta o poder de resolução • o gel é polimerizado com tampão pH 8.9, na presença do detergente Na+ dodecil sulfato (SDS)

42. H3C-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- Desnaturação de proteínas por SDS Sódio dodecil sulfato A porção hidrocarboneto do detergente interage com as regiões hidrofóbicas da proteína, dispondo o grupo sulfato carregado na superfície, em contacto com o meio aquoso. A repulsão entre os grupos fosfato desestabiliza os laços não covalentes que mantém a estrutura 3D da proteína, desnaturando-a. • Efeito do SDS • desnaturação uniformiza a forma das proteínas, que poderia influenciar na migração através dos poros da poliacrilamida; • mascara a carga natural das proteínas no pH da corrida, fazendo com que todas moléculas migrem para o anôdo; • facilita o efeito de redutores, rompendo pontes dissulfeto intra- e inter-cadeias

43. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE) O desenho ao lado mostra o tipo mais comum de cuba para PAGE. Na cuba, o gel é polimerizado entre duas placas de vidro ou plástico, afastadas 1 mm uma da outra. Antes da polimerização, um pente é colocado na parte superior do gel para formar os poços onde serão colocados de 5 a 20 microlitros de cada amostra, misturadas com azul de bromofenol, um indicador da corrida. As partes superior e inferior do gel fazem contacto com recipientes de tampão, onde estão os eletrodos que estabelecerão o campo elétrico (~100V) durante a corrida (1 a 2h). Terminada a corrida, as placas são retiradas da cuba, e o gel entre elas é cuidadosamente retirado e corado para revelar as bandas de proteína. Como corantes utiliza-se Coomassie Blue ou nitrato de prata. amostra Poços para as amostras catodo 1 mm tampão Placas de vidro gel anodo tampão cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

44. Padrões AB A A s s B B 2 - Mercaptoetanol A SH SH B Sem Com 2 - Mercaptoetanol SDS-PAGE das proteínas da bactéria Salmonella tiphymurium Eletroforese em MeioRedutor Adição do redutor 2-mercaptoetanol rompe pontes dissulfeto nas proteínas, possibilitando a determinação do número de cadeias e tipo de ligação entre cadeias de proteínas oligoméricas Direção da migração Cada linha (banda) corada no gel representa uma proteína

45. 21.0 97.4 87.0 45.0 29.0 12.5 6.5 (-) Massa molecular (kD) Mobilidade relativa (+) SDS-PAGE permite determinar a massa molecular de proteínas A migração eletroforética, expressa como mobilidade relativa, é proporcional ao logaritmo da massa molecular. Utiliza-se proteínas padrões com Mr conhecida para se fazer uma curva de calibração do gel em cada corrida. Interpolando-se a mobilidade relativa de uma proteína desconhecida na curva, pode-se estimar a sua massa molecular. Mr Mobilidade relativa = distância percorrida pela banda X distância percorrida pelo marcador da corrida Curva de calibração de SDS-PAGE Proteínas padrões em um SDS-PAGE

46. Terminamos aqui a 4ª.aula online do curso de Biofísica de Proteínas. • Os assuntos abordados nessa aula são: • Métodos de centrifugação e precipitação diferencial • Dosagem de proteínas • Métodos cromatográficos • Análise de eficiência da purificação Na aula prática, vocês terão oportunidade de ver alguns tipos de cromatografia funcionando.